Grazas por visitar Nature. A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses unha versión máis recente do navegador (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Ao mesmo tempo, para garantir a compatibilidade continua, mostraremos sitios sen estilos nin JavaScript.
A secuenciación xenómica revitalizou o campo da investigación de enfermidades infecciosas, revelando a epidemioloxía, a patoxénese, as interaccións hóspede-patóxeno e o proceso evolutivo imposto aos patóxenos. O complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) considera o Mycobacterium bovis como un dos seus membros adaptativos animais que causan a tuberculose (TB) nos mamíferos terrestres, e é un modelo típico de evolución bacteriana. Do mesmo xeito que outros membros do MTBC, suponse que o Mycobacterium bovis é un patóxeno estritamente clonado e de evolución lenta, e obviamente non hai signos de recombinación ou transferencia horizontal de xenes. Neste traballo, aplicamos a xenómica comparativa a un conxunto de datos de secuencia xenómica completa (WGS) composto por 70 M. bovinos de diferentes pedigrís (Europa e África) para obter información sobre a diversidade xenética do M. bovino. Poder evolutivo. Utilízanse tres métodos diferentes para estimar os signos de reorganización. A nivel mundial, identificouse e confirmouse un pequeno número de eventos de recombinación mediante dous métodos independentes con apoio sólido. Non obstante, en comparación coas mutacións, a recombinación ten un efecto máis débil sobre a diversidade de M. bovis (r/m global = 0,037). A diferenza r/m media obtida no complexo clonal de Mycobacterium bovis no noso conxunto de datos é consistente co concepto xeral de que o grao de recombinación pode variar moito entre as liñaxes asignadas á mesma especie taxonómica. Baseándose neste traballo, non se pode descartar a recombinación en Mycobacterium bovis, polo que debería ser obxecto de novos esforzos en futuras investigacións de xenómica comparativa, nas que a WGS de grandes conxuntos de datos de diferentes escenarios epidemiolóxicos de todo o mundo é crucial. A continuación, realizouse unha análise adicional no conxunto de datos máis pequeno de Mycobacterium bovis (n = 42) a partir da prevalencia de tuberculose multihóspede, e identificáronse máis de 1800 loci, dos cales polo menos unha cepa mostrou un polimorfismo dun só nucleótido (SNP). A maioría (87,1 %) están localizadas na rexión codificante, e a proporción global de cambios non sinónimos (dN/dS) de cambios sinónimos supera 1,5, o que indica que a selección positiva é unha forza evolutiva importante exercida sobre M. bovis. Detectouse unha maior proporción de SNPs en xenes ricos en categorías funcionais de "metabolismo lipídico", "procesos celulares e da parede celular" e "metabolismo e respiración intermedios", o que revela o seu potencial na bioloxía e evolución da importancia de Mycobacterium bovis. Unha ollada máis atenta aos xenes dos antepasados MTBC que son propensos á transferencia horizontal de xenes e están incluídos no sistema 3R (reparación, replicación e recombinación do ADN) revela o valor negativo medio global da proba D neutra de Taijima, que indica unha exploración selectiva pasada. O recente colo de botella despois da expansión da poboación segue a ser o principal factor impulsor evolutivo para que o patóxeno obrigatorio Mycobacterium bovis loite contra o hóspede.
O complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) é un dos taxons máis exitosos de patóxenos bacterianos e un caso típico de evolución bacteriana. Os seus membros mostran unha identidade de nucleótidos sorprendentemente alta a nivel xenómico (> 99 %)1,2. Diferentes ecotipos de MTBC poden causar tuberculose (TB), que é unha enfermidade granulomatosa infecciosa, nunha ampla gama de especies hóspedes, desde micromamíferos ata humanos3,4,5. Actualmente, o complexo inclúe humanos [M. tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] e patóxenos adaptados a animais (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" e "dassie")5,6. M. canettii (tamén coñecido como "Nodobacter glabrata") A identidade media de nucleótidos coas micobacterias mencionadas é do 98 %, e o traballo de xenómica comparativa demostrou que M. canettii e o resto dos MTBC diverxiron recentemente do antepasado común.7 Tendo en conta este concepto, algúns autores denominan a M. canettii Membro do MTBC 8.
O MTBC descríbese sistematicamente como un complexo clonal estrito, e a súa estrutura de poboación está claramente rexida por unha diversidade reducida, gargalos, escaneo selectivo e deriva xenética9,10. Asumindo que a evolución clonal estrita complexa, como os polimorfismos ausentes, non se pode restaurar mediante recombinación. Baseándose nesta premisa, propuxéronse os eventos consecutivos da deleción xenómica da rexión diferencial (RD) e TbD1 (rexión de deleción específica de Mtb 1) como marcadores moleculares da evolución do MTBC2,5,11. O traballo de xenómica comparativa e secuenciación do xenoma completo (WGS) apoia a división dos membros adaptados aos humanos en nove liñaxes (Mycobacterium tuberculosis L1 a L4, L7 e L8; e Mycobacterium africanum L5, L6 e L9), as liñaxes L2 a L4 compartían a rexión de deleción de TbD12,11,12,13. Ademais, propúxose que os membros adaptados a animais comparten un antepasado común, que se define por delecións específicas de clado en RD7, RD8, RD9 e RD102, 5 e 14.
A transferencia horizontal de xenes (THG) e os eventos de recombinación considéranse raros e ocorren nos antepasados dos MTBC, en lugar de na historia diferente de todo o membro do MTBC15,16,17. Dous informes iniciais de Hughes e colaboradores (2002) e Gutacker e colaboradores (2006) suxeriron que os eventos de recombinación poden axudar a dar forma aos polimorfismos que marcan loci específicos nas cepas de M. tuberculosis18,19. As razóns da evidente falta de recombinación nos MTBC son: (1) o proceso mecánico e a perda de capacidade da TGH; (2) a rareza dos eventos de TGH; (3) non hai posibilidade de eventos de recombinación no nicho do MTBC14,17. Recentemente, algúns estudos de secuenciación do xenoma completo (WGS) aplicados á cepa 20 do MTBC e a Mycobacterium bovis 21 proporcionaron evidencias de recombinación, sendo os primeiros en demostrar que as cepas de MTBC adoitan intercambiar pequenos fragmentos de ADN, pero debido á limitada variación da secuencia de nucleótidos, estes eventos aínda non se notan.
Mycobacterium bovis é o membro do MTBC recuperado con máis frecuencia do gando (principalmente vacún), aínda que tamén se pode illar de animais salvaxes en liberdade e cercados4,22,23,24. M. bovis evolucionou en cinco complexos clonais principais [European 1 (Eu1), European 2 (Eu2), European 3 (Eu3), African 1 (Af1) e Africa 2 (Af2)], segundo o perfil de spoligotipificación, delecións específicas e polimorfismos dun só nucleótido (SNP)25, 26, 27, 28, 29 en xenes específicos. Estes complexos clonais demostran a estrutura diversa da poboación de Mycobacterium bovis e a súa asociación con rexións xeográficas. Ademais, o traballo recente de WGS levado a cabo por Zimpel e os seus colaboradores (2020) deseñou unha filoxenia baseada no SNP de Mycobacterium bovis, con máis de 1900 xenomas, o que indica que existen polo menos catro liñaxes diferentes (denominadas Lb1 a Lb1 a Lb4), que non son completamente consistentes co complexo clonal definido previamente, aínda que tamén se pode confirmar a especificidade xeográfica30. Estes autores realizaron análises diferenciais da filoxenia e datación molecular, pero non estudaron a recombinación30.
Traballos previos empregando diferentes técnicas moleculares, como a espoligotipificación, a MIRU-VNTR (unidade de repetición intercalada de micobacterias con número variable de repeticións en tándem) e a tipificación recente de SNP revelaron un certo nivel de diversidade xenética entre as cepas de M. bovis 31, 32, 33, 34, 35. A diferenciación da variación xenética converteuse nunha ferramenta importante no estudo da epidemioloxía de enfermidades, o que resulta útil para unha comprensión profunda da patoxénese, a virulencia e a transmisión de enfermidades. A aparición do método WGS ofrece a posibilidade de revelar os factores impulsores evolutivos impostos polo xenoma de Mycobacterium bovis no proceso de adaptación e persistencia a diferentes hóspedes e escenarios epidemiolóxicos.
Neste traballo, empregamos a análise xenómica comparativa en varios conxuntos de datos de Mycoplasma bovis (n=70), incluíndo illamentos de diferentes complexos clonais, para obter información sobre o proceso evolutivo de Mycoplasma bovis, especialmente para resolver as relacións filoxenéticas e os eventos de recombinación. Como complemento a esta análise, explorou máis a fondo un conxunto de subdatos de illamentos de M. bovis (n=42) obtidos dunha área de tuberculose multihóspede ben caracterizada en Portugal 31,36 para inferir a non identidade. O equilibrio entre a proporción relativa de substitucións de nucleótidos sentido (dN) e sinónimas (dS), así como a contribución evolutiva de xenomas específicos mencionados na literatura, que son 37,38 obtidos por antepasados MTBC a través de HGT e codifican compoñentes xénicos do sistema 3R (reparación, replicación e recombinación do ADN) 39. Escollemos xenes obtidos a través de HGT porque poden representar polimorfismos antigos, polo que se espera que poidan conter unha maior proporción de cambios sinónimos. Os xenes incluídos no sistema 3R foron seleccionados porque traballos previos sobre cepas de M. tuberculosis indicaban seleccións xerais negativas/de purificación que funcionan sobre estes xenes, e que poden desempeñar un papel importante na evolución 39. Outro obxectivo deste traballo é inferir a existencia de eventos de reorganización. Por este motivo, considerando que o noso conxunto de datos de Portugal só contén os xenomas do complexo clonado europeo 2 e as cepas ás que non se lles asignou o complexo clonado, decidimos incluír datos xenómicos dispoñibles publicamente para obter finalmente un representativo de todos os complexos clonados e mellorar a robustez e a amplitude dos resultados.
42 xenomas de Mycoplasma bovis recentemente secuenciados do escenario endémico de tuberculose multihóspede portugués (detalles a continuación), previamente caracterizados desde unha perspectiva epidemiolóxica36, constitúen o centro deste traballo. Tendo en conta que o conxunto de datos de Portugal só ten representantes dos complexos de 2 clons europeos e cepas sen complexos designados, engadíronse datos de secuenciación de xenoma completo dispoñibles publicamente para ampliar o conxunto de datos que inclúe todos os representantes dos complexos de clóns de M. bovis. Polo tanto, utilizáronse tres fontes de datos de secuenciación de xenoma completo neste traballo: ensamblaxe de xenomas completa/borrador, ata 10 armazóns almacenadas no NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnolóxica) (n = 15 illamentos); almacenadas en SRA (o ficheiro Illumina fastq do arquivo de lectura de secuencias) representa a diversidade complexa dos clóns de M. bovis (n = 12 illamentos)30; e 42 xenomas recentemente secuenciados de Portugal. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) foi excluído da busca do NCBI. O *M. bovis* AF2122/97 adoita empregarse como xenoma de referencia para incluír no conxunto de datos. Debido á indisponibilidade pública da secuencia xenómica completa representada polo complexo de clonación African 1 e ao pequeno número de xenomas de cepas representativas de Af2 e Eu1, nestes casos empregáronse os datos de secuenciación orixinais proporcionados por SRA. O traballo de Zimpel e os seus colaboradores (2020) axudou a identificar o xenoma do complexo de clonación mencionado anteriormente e axudou a seleccionar *Mycobacterium bovis* para a súa inclusión no conxunto de datos. Para Eu3, só se describe un tipo de xenoma (Branger et al., 2020), polo que o xenoma que incluímos é un representante separado do complexo Eu3.
A nivel mundial, este conxunto de datos inclúe 70 M. bovis de gando illados de 8 especies hóspedes, distribuídas en 12 países entre 1985 e 2016. 36 especies están designadas como Eu2, 7 especies son Eu1, 1 especie é Eu3, 3 especies son Af1, 4 especies son Af2 e 19 non son atribuíbles a ningún complexo clonal (detalles a continuación). A información detallada (incluído o número de acceso) de Mycobacterium bovis empregada neste estudo móstrase na Táboa 1 e na Táboa Suplementaria 1.
42 xenomas completos de Mycobacterium bovis recentemente secuenciados dos focos de tuberculose animal de Portugal e distribuídos durante máis de 12 anos son o centro deste estudo, xa que os posibles sistemas de enfermidades entre a fauna salvaxe e o gando foron monitorizados regularmente 31,36 (Figura suplementaria 1). Segundo os procedementos posteriores, estas cepas foron illadas de gando vacún (n = 14), cervos (n = 16) e xabarís (n = 12) de 2003 a 2015: recoller e manipular os animais de acordo coas directrices do protocolo recomendadas. As mostras de tecido están no Manual de Animais Terrestres da OIE e inóculanse en medio sólido de piruvato Stonebrink e Löwenstein-Jensen e medio líquido. Os cultivos incúbanse a 37 °C e o crecemento compróbase unha vez por semana durante polo menos 12 semanas. As colonias almacénanse directamente nunha solución de glicerol a -80 °C. No medio selectivo para Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), as mostras arquivadas orixinais pasaron por unha única pasaxe in vitro para obter o ADN do programa WGS. Para isto, a solución madre de cultivo conxelada enriqueceuse con piruvato de sodio ao 5 % e ADS ao 10 % (50 g de albumina, 20 g de glicosa, 8,5 g de cloruro de sodio en 1 L de auga) en Middlebrook 7H9 a 37 °C. Despois de 4 semanas de crecemento, renovouse o medio e o cultivo monitorizouse regularmente ata que se observou crecemento. As células recolléronse por centrifugación, o precipitado resuspendiuse en 500 µL de solución salina tamponada con fosfato (PBS), quentouse a 99 °C durante 30 minutos, centrifugouse e o sobrenadante almacenouse a -20 °C ata a WGS. Todos os procedementos lévanse a cabo en instalacións de bioseguridade de nivel 3.
A biblioteca de xenomas de extremos pareados WGS prepárase empregando o índice único de cada mostra de ADN e emprega a tecnoloxía Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 mostras) e HiSeq (2 × 150 pb) (dous illamentos) (Eurofins Genomics, Alemaña) para a secuenciación. Segundo as instrucións do fabricante, use o Illumina Genome Analyzer con módulo de dobre extremo para secuenciar o ADN xenómico e use o kit de preparación da biblioteca de ADN Nextera XT de Illumina para construír a biblioteca.
Tendo en conta os datos recuperados da SRA (n = 12), a identificación do complexo clonal pódese usar como metadatos da publicación correspondente 30, 41, 43. Ao considerar o xenoma completo, agás Mycobacterium bovis AF2122/97 e Mycobacterium bovis 3601, que son membros recoñecidos do complexo clonal Eu1 e Eu3 25, 29, respectivamente, é o mesmo que o xenoma completo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (número de acceso do NCBI NC_000962.3). O aliñamento do xenoma realízase usando MAFFT (programa de aliñamento múltiple de secuencias de aminoácidos ou nucleótidos, versión 7.458) e o parámetro -addfragments48. Despois, busca a ausencia de diferentes complexos clonais e/ou a presenza de características de SNP.
O Mycobacterium bovis recentemente secuenciado (n = 42) e as lecturas orixinais do borrador do xenoma ensamblado (n = 3) aliñan o complexo co xenoma de referencia Mycobacterium tuberculosis H37Rv a través da canle vSNP e a presenza da deleción e/ou características de SNP de diferentes clons. Realizouse unha busca.
Recompilar información a partir da falta de características e/ou da presenza/ausencia de perfís de SNP e de spoligotipificación para asignar datos xenómicos ao complexo clonal correspondente. Para os catro borradores de ensamblaxes, o perfil de spoligotipificación non se pode inferir, polo que se inclúen no grupo "sen complexidade".
O fluxo de traballo bioinformático seguido por este traballo comeza desde a ensamblaxe de novo e o mapeo a unha estratexia de referencia, co obxectivo de explorar eventos de recombinación e polimorfismos xenómicos específicos. A Figura 1 ofrece un diagrama de fluxo dos pasos seguidos. Para a análise de recombinación, utilízanse todos os xenomas para aumentar a robustez das inferencias e os indicadores relacionados.
Para reducir os erros na xeración de secuencias de consenso do xenoma, primeiro obtivemos a ensamblaxe de novo e, a continuación, obtivemos aliñamentos múltiples principais. A canle Unicycler está dispoñible actualmente en https://github.com/rrwick/Unicycler49 e utilízase para realizar a ensamblaxe de novo de 54 xenomas secuenciados (42 recentemente secuenciados e 12 ficheiros fastq recuperados de SRA). En resumo, antes da ensamblaxe desde cero, realizouse unha análise da calidade de lectura en FastQC versión 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) e Trimmomatic versión 0.36 (aplícanse as opcións "cortar adaptadores e outras secuencias específicas da iluminación a partir de lecturas" e "Cortar bases desde o final da lectura, se é inferior á calidade límite de 20") (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. Despois, utilizouse o optimizer49 de SPAdes para a ensamblaxe do xenoma e a versión 1.1851 de Pilon para a optimización posterior á ensamblaxe. Seleccionouse un modo de ponte conservador para evitar a ensamblaxe incorrecta e buscouse e seleccionouse o tamaño dos k-mer entre o 20 % e o 95 % da lonxitude de lectura. Siga as pautas de SPAdes e teña en conta o tamaño de lectura, elimine os contigs menores de 300 pb e estableza un límite de cobertura de profundidade de lectura de 20 de 52. Na estratexia de ensamblaxe de novo, non se eliminaron as rexións xenómicas como os parálogos prolina-glutamato (PE) e prolina-prolina glutamato (PPE), altamente repetitivos.
A calidade da ensamblaxe de novo avalíase a través da canle QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), que facilita a renovación do contig e o mapeo do xenoma de referencia de M. bovis AF2122/97 (número de acceso do NCBI LT708304.1) (véxase a Táboa Suplementaria 1 para os parámetros de calidade).
Coa axuda da canle vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), o ficheiro FASTQ do M. bovis recentemente secuenciado a partir da secuenciación de Illumina compárase co xenoma de referencia de M. bovis AF2122/97 (LT708304.1). De acordo coas recomendacións de boas prácticas do Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55, aplícanse parámetros de filtro estándar ou puntuacións de masa variante para a recalibración. Os resultados fíltranse usando a puntuación de masa máis baixa de SAMtools de 150 e AC = 2. Tamén se usa Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) para comprobar as lecturas para descartar a contaminación. A canle vSNP utilizada para mapear as estratexias de secuenciación no noso traballo examina unha serie de SNP e dianas definidos, e tamén exclúe escenarios de infección mixta. A cobertura do xenoma lido é mellor que o 99 % (Táboa suplementaria 1).
Para evitar erros de mapeo e SNP incorrectos, filtre unha variante nos seguintes casos: (1) está respaldada por menos de 20 lecturas, (2) atópase cunha frecuencia inferior a 0,9, (3) está en polo menos unha cepa, pero polo menos hai lagoas noutra cepa. O visor de xenómica integrado (IGV) versión 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 utilizouse para verificar visualmente os SNP e as posicións con problemas de mapeo ou aliñamento. Dado que os xenes prolina-glutamato (PE) e prolina-prolina glutamato (PPE) están moi duplicados e forman parte dunha familia multixénica, a secuenciación e o mapeo incorrecto de Illumina os malinterpretan facilmente, polo que se prefiren. O fluxo de traballo da bioinformática micobacteriana eliminou membros do complexo da tuberculose ao usar a estratexia de mapeo á secuencia para confirmar os SNP. Polo tanto, filtramos os xenes PE/PPE e as delecións da análise.
Segundo Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), todos os SNP divídense en categorías funcionais. O fluxo de traballo SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) utilízase para inferir as consecuencias dos SNP (cambios sinónimos ou non sinónimos). Creouse unha nova base de datos do xenoma de Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
O aliñamento múltiple do xenoma central realizouse empregando Parsnp v1.2, dispoñible actualmente en https://github.com/marbl/parsnp57, empregando 69 xenomas completos/borradores de ensamblaxes (coa opción -c) e utilízase M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) como referencia. Realizáronse catro aliñamentos múltiples centrais: só os membros do complexo de clonación Eu2 (n = 37), incluíndo todos os membros do complexo de clonación europeo (n = 44), incluíndo o punto de unión do complexo de clonación europeo e africano (n = 51) e inclúese todo Mycobacterium bovis neste estudo (n = 70).
O aliñamento central xerado por Parsnp utilízase para inferir a árbore filoxenética de máxima verosimilitude (ML) empregando CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 usando RAxML e realizar 1000 replicacións guiadas.
Empréganse tres algoritmos e ferramentas bioinformáticas diferentes para comprobar a presenza de eventos de recombinación en paralelo: o software SplitsTree4, o pipeline Gubbins (liñaxe imparcial a través da recombinación en secuencias de nucleótidos) e o software RDP4 (programa de detección de recombinación, versión beta 4.101).
O método de descomposición dividida implementado en SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 utilízase para calcular a rede filoxenética sen raíces, usando a proba Phi para a verificación estatística, e o limiar de significancia é p = 0,05. A análise multialiñamento central de Parsnp utilízase como entrada e realízase a descomposición dividida como estándar de rede.
A canle de Gubbins v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) execútase con parámetros predeterminados como outra forma de avaliar o impacto da recombinación en Mycobacterium bovis. O algoritmo implementado na canle reconstrúe a liñaxe de clones relevante. O ensamblaxe completa do xenoma/borrador do noso conxunto de datos e o xenoma de referencia (bóvido bovino AF2122/97, LT708304.1) son mutuamente; e escanean a posición do SNP en cada rama da árbore para detectar o clúster de SNP que representa o evento de recombinación. O cero da rama Suponse que non hai ningún evento de recombinación, o que significa que os SNP que se producen na rama deberían estar distribuídos uniformemente. O aliñamento múltiple central de Parsnp e a árbore ML con mellor puntuación de RAxML utilízanse como ficheiros de entrada.
Finalmente, para confirmar o evento de reorganización suxerido pola cadea de Gubbins, os seis algoritmos implementados en RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 e SiScan66) aplícanse ao aliñamento múltiple central de Parsnp coa configuración predeterminada. Determinamos que polo menos tres dos algoritmos implementados en RDP4 deben demostrar sistematicamente un sinal importante para verificar cada evento de recombinación.
Tendo en conta que tanto o software Gubbins como o RDP buscan sinais de recombinación comprobando os aliñamentos múltiples principais nunha xanela de ata 500 pb, e confirmando que a inclusión de xenes PE/PPE durante a ensamblaxe de novo non interferirá cos sinais de recombinación atopados, realízase unha análise adicional mediante homolinearidade. Comprobe a veciñanza do xene que identifica o evento de recombinación. O mapa sinlineal usando o xenoma completo construíuse usando o aliñamento MAUVE-multi-genome (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) para excluír translocacións ou inversións locais do xenoma. Ademais, utilizouse o xenoma completo para realizar unha análise de homolinearidade na secuencia de aminoácidos a través do servidor web SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Unha análise máis profunda do conxunto de datos xenómicos obtidos do sistema portugués de tuberculose multihóspede consiste en comprobar o polimorfismo dos xenes mencionados na literatura. Estes xenes son37,38 e o xene que codifica 3R obtido polos antepasados do MTBC a través de compoñentes do sistema HGT (reparación, replicación e recombinación do ADN)39. Usar ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) e usar DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) para calcular a diversidade xénica e a diversidade de nucleótidos (π) e a entrada do parámetro da proba D neutra de Tajima.
Obtívose unha árbore filoxenética de máxima verosimilitude (ML) baseada en 69 illamentos de Mycoplasma bovis e xenomas de referencia (Figura 2A). En comparación coas árbores baseadas nun só xene ou en múltiples locus, esta estratexia permite a xeración de árbores máis potentes que non capturan a variabilidade de todo o xenoma e, polo tanto, presentan unha menor capacidade para discriminar entre especies 68,69. A estrutura topolóxica da árbore ML adoita ser consistente coa clasificación complexa dos clons. O xenoma de Eu2 está agrupado nunha rama e o xenoma de Af1 tamén está agrupado (Figura 2A). O resultado tamén é consistente coa relación evolutiva coñecida de Mycobacterium bovis, é dicir, hai unha gran diferenza entre o membro de Eu1 e o grupo que consiste en todos os demais complexos e xenomas clonais, pero o complexo clonal 30 non se especifica. A pequena inconsistencia entre o complexo clonal e a relación observada na árbore filoxenética pódese explicar polo feito de que o complexo clonal se describe en función de rexións xenómicas específicas, mentres que a árbore filoxenética se basea en múltiples aliñamentos de xenomas principais que representan o xenoma completo.
A árbore filoxenética de máxima verosimilitude (RTM) constrúese baseándose no aliñamento do xenoma central de Mycobacterium bovis antes (A) e despois (B) da eliminación do sitio de recombinación. As cores das ramas representan o complexo clonal de Mycobacterium bovis: Europa 1 é púrpura, Europa 2 é vermella, Europa 3 é azul, África 1 é laranxa e África 2 é verde. A árbore ten raíces e debuxouse a escala, e a lonxitude da rama mídese como substituto de cada sitio.
O complexo Mycobacterium tuberculosis descríbese como evolucionado clonalmente, e a maior parte das evidencias acumuladas ao longo dos anos apoian a idea de que os eventos de HGT e recombinación en curso non se producirán ao nivel detectable de MTBC15,17,18.
Traballos anteriores demostraron que pode haber unha recombinación limitada entre as cepas de MTBC20,21, mentres que outros non identificaron eventos de recombinación mensurábeis70,71. Volva a analizar este problema centrándose en Mycobacterium bovis, que é diferente do traballo anterior que só consideraba Mycobacterium tuberculosis70,71; ou considere o MTBC no seu conxunto, case sen M. bovis representando 20; ou considere só as fraccións restritivas de gando. No conxunto de datos de micobacterias, neste traballo, hai un total de 70 cepas, que representan todos os complexos clonais, utilizadas para detectar a recombinación. O conxunto de datos está escalado segundo catro niveis acumulativos: (1) membros de Eu2, (2) todos os membros do complexo clonal europeo (é dicir, Europa), (3) complexo clonal europeo e africano (Eu + Af) e (4) as coleccións de datos completas (incluíndo xenomas que non están incluídos en ningún complexo de clonación xa descrito).
Para estudar máis a fondo esta hipótese, realizouse unha rede de descomposición dividida para avaliar a ausencia de eventos de recombinación entre xenomas, porque este método pode visualizar a relación ancestral entre individuos e mostrar sinais filoxenéticos contraditorios. Os catro conxuntos de datos da análise confirmaron a existencia de bucles na rede (é dicir, áreas que non converxen nunha soa árbore), pero a proba Phi non ten soporte estatístico (Eu2, p = 0,0956; Europa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; o conxunto de datos completo p = 0,2451), o que proporciona evidencias deficientes da existencia de eventos de reorganización (Figura 3A-D).
En Europa 2 xenomas (n = 37) (A), xenomas europeos (n = 44) (B), xenomas europeos e africanos (n = 51) (C) e o conxunto de datos completo (n = 70) (D).
Tras esta análise, e tendo en conta as observacións cíclicas en todas as redes, aplicouse o algoritmo de reconstrución implementado na cadea de Gubbins para reconstruír a liñaxe clonal e complementar a estimación do efecto da recombinación no xenoma de M. bovis. Inferir o número acumulado de eventos de recombinación, a maioría dos cales ocorreron en ramas terminais (é dicir, nun só xenoma) (Táboa 2). Estes indicadores mostran a consistencia de todo o conxunto de datos e indican que a frecuencia dos eventos de recombinación é de 200 a 300 veces maior que a das mutacións. Unha vez que o parámetro rho/theta que representa as taxas relativas de recombinación e mutacións puntuais na rama parece estar entre 0,0037 e 0,0056 (Táboa 3). Recentemente, o traballo publicado da cepa 38 de M. bovis demostrou un valor rho/theta maior (rho/theta = 0,1) que o obtido neste conxunto de datos, pero o traballo de Patané e os seus colegas empregou a ensamblaxe baseada en referencias para inferir os parámetros de recombinación. Un detalle procedimental, debido ao procedemento de ensamblaxe, foi asociado coa abundancia de supostos eventos de recombinación na rama terminal.
A continuación, o parámetro r/m representa a razón de diversidade de recombinación e introdución de mutacións, e o seu valor medio está entre 0,025 e 0,037, o que indica que, en comparación coas mutacións, a recombinación ten un menor impacto global na diversidade xenética de M. bovis (Táboa 3). Para unha comparación extensa, utilizouse un método similar para estimar o parámetro r/m para o conxunto de datos MTBC composto por 23 xenomas, mostrando un valor medio de 0,48620, mentres que para o conxunto de datos de 38 M. bovis de Patané e colegas, demostrouse que o valor medio é de 0,98. No primeiro estudo, só dous dos 23 xenomas incluídos no traballo de M. bovis (M. bovis BCG e a cepa de referencia), polo que o valor obtido pode estar sesgado debido á sobreexpresión do xenoma de M. tuberculosis. No segundo informe, as poboacións analizadas de Mycobacterium bovis recuperáronse principalmente dos Estados Unidos e de hóspedes gandeiros. En contraste, no noso conxunto de datos, represéntanse máis localizacións xeográficas e especies hospedadoras, e tamén se empregan xenomas agrupados en diferentes complexos clonais con diferentes características xenéticas da poboación, conseguindo así un coñecemento da poboación máis profundo e amplo. A diferenza de valor medio r/m obtida co noso conxunto de datos é consistente co concepto de que o grao de recombinación varía moito entre as liñaxes asignadas á mesma especie taxonómica, polo que estes resultados indican que o complexo clonal de M. bovis pode exhibir diferenzas de recombinación. O impacto tamén é o suxerido por Didelot & Maiden72. Non obstante, ampliar significativamente este conxunto de datos incluíndo un maior número de xenomas de M. bovis permitirá aclarar aínda máis este punto. Tanto os parámetros r/m como rho/theta mostran variabilidade entre as ramas, e este resultado é consistente con informes sobre outras especies bacterianas72,73.
Finalmente, para confirmar os eventos de reorganización identificados pola cadea de Gubbins, empregáronse seis algoritmos diferentes no software RDP4 para probar de forma independente diferentes multicomparacións principais. A nivel mundial, menos da metade dos eventos identificados por Gubbins foron confirmados por RDP4 (táboas 4 e 5). Considerando o conxunto de datos completo, confirmáronse tres eventos de recombinación, dous que implicaron nodos internos e o outro un único xenoma nunha rama terminal, para o que non se puideron asignar complexos clonais (táboas 4 e 5). A identificación de eventos nas ramas terminais pode indicar que a recombinación aínda está en curso nas cepas contemporáneas de M. bovis ou que o resultado está mal colocado70. Nesta hipotética rexión de recombinación, aproximadamente o 20 % das posicións teñen nucleótidos (N) non definidos, o que afecta o sinal de recombinación (Figura suplementaria 2). Ademais, esta rexión afecta o xene rrs, que codifica o ARN ribosómico 16S que se espera que estea altamente conservado, polo que este suposto sinal de recombinación pode ser o resultado de erros de secuenciación ou desalineamento. Despois realizouse o aliñamento completo do xenoma entre Mb0003 e Mycobacterium bovis AF2122/97, e confirmouse a existencia de nucleótidos e SNPs non definidos, polo que os posibles problemas relacionados co aliñamento incorrecto non se debían á información biolóxica implementada neste traballo. Apareceu despois de aprender o programa.
Non se atoparon lagoas nin nucleótidos indefinidos nas rexións de recombinación dos nodos internos (Figuras 4 e 5). En canto a estes eventos, un contén só o xenoma Eu2 e afecta o xene pks12, que codifica unha posible policétido sintase; mentres que o outro está rexistrado no xenoma Eu1 e afecta o xene narX que codifica unha posible nitrato redutase (Táboa 4). En xeral, a análise de recombinación mostra que hai un número limitado de fragmentos de recombinación con soporte estatístico, e os indicadores inferidos indican que a recombinación ten un baixo impacto na liñaxe de M. bovis. Espérase que o sinal de recombinación sexa baixo, pero é importante distinguir o verdadeiro sinal de evolución do ruído de fondo, o que supón unha tarefa complexa. Para reducir o sinal de ruído introducido polos problemas de ensamblaxe baseados en referencias e de desaxuste 70, 71, todo o resto, excepto o xenoma completo, ensambláronse desde cero, e a calidade da ensamblaxe comprobouse e asegurouse mediante a análise da cadea QUAST (Táboa suplementaria 1). Ademais, realizouse unha serie de análises suplementarias para garantir a robustez e a precisión do estudo xeral. Polo tanto, a calidade da secuenciación dos xenes narX e pks12 avaliouse mediante o mapeo de lectura contra Mycobacterium bovis AF2122/97. A posición recomendada do SNP na rexión de recombinación confirmouse aplicando os criterios mencionados na sección do método (polo menos 20 lecturas e unha frecuencia de cambio do 0,9). O polimorfismo do xene narX confirmouse totalmente nos dous xenomas (Mb1792361 e Mb7240415; 2,3 %) e nos xenomas do xenoma pks12: xenes Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 e Mb12. Non obstante, para o xenoma Mb2043, seis das oito posicións non cumpren o criterio de profundidade de lectura porque o SNP está soportado por un máximo de 17 lecturas, o que está por debaixo do valor de corte establecido de 20. Polo tanto, pódese confirmar a recombinación de seis xenomas (8,6 %) neste sitio do xenoma (figuras 4 e 5).
A visualización detallada da aliñación da rexión de recombinación do conxunto de datos de Mycobacterium bovis afecta ao xene narX que codifica unha posible nitrato redutase. Non se atoparon lagoas nin nucleótidos indefinidos na rexión de recombinación dos nodos internos. Este evento en particular está rexistrado no xenoma Eu1. A calidade da secuenciación do xene narX avaliouse representando graficamente as lecturas de Mycobacterium bovis AF2122/97. Confirme a localización recomendada do SNP na área de recombinación aplicando os criterios mencionados na sección do método (polo menos 20 lecturas e unha frecuencia de cambio do 0,9). O polimorfismo do xene narX confirmouse totalmente nos xenomas de Mb1792361 e Mb7240415 (2,3 %).
Visualización detallada do aliñamento da rexión de recombinación do conxunto de datos de Mycoplasma bovis que afecta o xene pks12. Non se atoparon lagoas nin nucleótidos indefinidos na rexión de recombinación dos nodos internos. En canto ao evento que afecta o xene pks12 que codifica a posible policétido sintase, só contén o xenoma Eu2. A calidade da secuenciación de pks12 avaliouse mediante o mapeo de lectura de Mycobacterium bovis AF2122/97. Confirme a localización recomendada do SNP na área de recombinación aplicando os criterios mencionados na sección do método (polo menos 20 lecturas e unha frecuencia de cambio de 0,9). Os polimorfismos dos xenomas Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 e Mb1960 foron totalmente confirmados.
Os xenes PE e PPE teñen rexións repetitivas que se len mal con facilidade coa secuenciación e o mapeo incorrecto de Illumina, polo que normalmente se eliminan do fluxo de traballo bioinformático dos membros de M. tuberculosis só cando se usa a estratexia de mapeo a secuencia. A inferencia de eventos de recombinación aplicada neste traballo baséase na ensamblaxe de novo sen filtrar PE/PPE. Cremos que, ao implementar tres métodos e algoritmos complementarios diferentes a través de SplitsTree, a canle de Gubbins e o software RDP4, as estratexias aplicadas son robustas para o procesamento e filtrado das rexións reorganizadas causadas por sinais de erro. Non obstante, para excluír a interferencia do xene PE/PPE no software Gubbins e RDP4 para identificar clústeres de SNP e, polo tanto, a identificación das rexións de recombinación que se propón que afectan aos xenes narX e pks12, examinouse a veciñanza destes xenes (Fig. suplementaria 3-5). En M. bovis AF2122/97, o xene narX está separado por narK2 e Mb1764c, mentres que pks12 está rodeado por Mb2075c e Mb2073c (Figura suplementaria 3-5). O mapa xerado usando o mapa de sinlíneas MAUVE do xenoma completo proporciona información sobre a conservación e o rearranxo da secuencia xénica, mostrando catro bloques colineais e ningún signo de translocación ou inversión do xenoma. Ademais, a análise de complementación coa secuencia de aminoácidos demostrou a homoloxía en todos os xenomas completos e non se atopou PE/PPE nas rexións adxacentes de narX ou pks12. Para narX, un xenoma (Mb0030) ten unha puntuación de sinonimia máis baixa porque o xene narX foi identificado como dous fragmentos (fragmentos 1891 e 1890). Para pks12, debido ás semellanzas, Mb0030 e Mb003 mostraron puntuacións de sinlinearidade máis baixas, mentres que pks12 identificouse en dous e tres fragmentos, respectivamente, que representan diferentes dominios da proteína (Figura suplementaria 3-5). Tendo en conta esta información, e que tanto o software Gubbins como o RDP4 realizan análises, comproban o aliñamento múltiple central do máximo de 500 pb na xanela, confirmamos que o xene PE/PPE non interferirá co sinal de recombinación que afecta a narX e pks12.
Aínda que os sinais de recombinación detectados neste conxunto de datos poden considerarse residuais, é certo que non se pode descartar a recombinación en M. bovis, polo que debería seguir sendo obxecto de análises posteriores, nas que se secuencien xenomas completos de diferentes escenarios epidemiolóxicos para que sexan importantes.
A comparación das árbores filoxenéticas ML obtidas antes e despois da corrección da recombinación (Figura 2A, B) non levou a cambios significativos na relación filoxenética inferida, e as cepas de M. bovis agrupáronse no mesmo grupo.
Tras mapear 42 lecturas de M. bovis recentemente secuenciadas co xenoma de referencia de M. bovis AF2122/97, obtívose un aliñamento de SNP que contén 1816 posicións polimórficas. A maioría dos SNP (87,1 %) están situados na rexión codificante e os xenes afectados caracterízanse segundo as categorías funcionais que se mostran en Bovilist (Figura 6A, B). Tendo en conta o número total de xenes en cada categoría funcional, os xenes da categoría "metabolismo lipídico" mostraron máis SNP, seguidos dos "procesos da parede celular e da célula" e "metabolismo e respiración intermedios", o que revela que están na evolución de M. bovis.
Análise xerárquica do conxunto de datos de M. bovis de Portugal (n = 42). Número total de SNP rexistrados e xenes afectados para cada categoría funcional (A). Número total de cambios sinónimos e non sinónimos rexistrados por categoría funcional (B).
A escala global, a proporción media de dN/dS é mellor que 1,5, o que indica que a presión evolutiva global é a de desfacerse do estado ancestral e representa un escenario de elección de purificación positivo (diversificado ou dirixido) e/ou relaxado. Nas categorías de "virulencia, desintoxicación, adaptación", "secuencias de inserción e fagos" e "proteínas reguladoras", máis de dous terzos dos SNP non son sinónimos (Figura 6B).
En todas as categorías, hai xenes con múltiples SNPs, o que resulta nunha taxa de mutación media (é dicir, o SNP medio por xene) superior a 1 (Figura 6A). Pks12 (Mb2074c) con 15 SNPs e fas (Mb2553c) con 8 SNPs teñen valores de mutación máis altos. Ambos xenes están implicados no metabolismo dos ácidos graxos. O xene pks codifica a policétido sintase (PKS), que é un encima multifuncional implicado na biosíntese de lípidos da parede celular micobacteriana74,75. Este xene codifica un polipéptido multifuncional que está implicado na síntese de micocétidos74,76. O xene fas está implicado na síntese do ácido micólico. Ambos xenes desempeñan un papel importante na biosíntese da parede celular en contacto co hóspede.
Co fin de estudar máis a fondo a evolución de Mycobacterium bovis, analizáronse dous conxuntos de xenes específicos. Traballos publicados previamente que empregaban métodos de composición de secuencias e filoxenéticos identificaron xenes que foron adquiridos por antepasados do MTBC a través da HGT antes da diversificación37,38. Estes xenes aparecen listados na Táboa suplementaria 2. Analizouse a distribución de SNP dun total de 77 xenes que poden estar relacionados coa HGT e identificáronse 26 sitios polimórficos, que na maioría dos casos (78 %) resultaron en cambios non sinónimos (NS) (Táboa suplementaria 2). Traballos previos sobre o xenoma do MTBC demostraron que a suposta rexión HGT presenta unha maior proporción de SNP NS en comparación co resto do xenoma. Se se pensa que estas rexións de recombinación foron adquiridas por antepasados do MTBC e, polo tanto, sobrerepresentan polimorfismos antigos, espérase que a proporción de cambios sinónimos sexa maior, porque se espera que as substitucións NS se eliminen por selección negativa debido a que os cambios de aminoácidos poden alterar a función da proteína. Polo tanto, os nosos resultados indican que as consecuencias funcionais poden derivarse da substitución de xenes similares a HGT, o que reflicte a súa importancia para unha valiosa diversidade xenética adaptativa.
Paralelamente a esta análise, examináronse exhaustivamente os xenes que codifican os compoñentes do sistema 3R (reparación, replicación e recombinación do ADN) de acordo coa lista publicada previamente por dos Vultos e colaboradores (2008)39. O intercambio de fragmentos de ADN idénticos non se pode observar directamente, aínda que pode ser un proceso frecuente cando hai bacterias estreitamente relacionadas, como no caso deste conxunto de datos; ademais, este proceso pode ser a clave para os métodos de reparación do ADN72, polo que desempeña un papel na recombinación homóloga. Identificáronse un total de 26 posicións polimórficas distribuídas por 54 xenes (Táboa suplementaria 3). Neste conxunto de xenes, os cambios na NS representaron arredor do 65 % das consecuencias, o que é consistente con informes previos sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis.
Data de publicación: 21 de outubro de 2021