റീകോമ്പിനേഷൻ, മ്യൂട്ടേഷൻ, പോസിറ്റീവ് സെലക്ഷൻ എന്നിവയുടെ ജീനോം-വൈഡ് കണക്കുകൾ മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസിന്റെ വൈവിധ്യമാർന്ന ഡ്രൈവറുകളെ പ്രചോദിപ്പിക്കുന്നു.

നേച്ചർ സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി. നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന ബ്രൗസർ പതിപ്പിന് CSS-ന് പരിമിതമായ പിന്തുണയേ ഉള്ളൂ. മികച്ച അനുഭവത്തിനായി, ബ്രൗസറിന്റെ പുതിയ പതിപ്പ് ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ ഇന്റർനെറ്റ് എക്സ്പ്ലോററിലെ കോംപാറ്റിബിലിറ്റി മോഡ് ഓഫ് ചെയ്യുക). അതേസമയം, തുടർച്ചയായ പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, സ്റ്റൈലുകളും ജാവാസ്ക്രിപ്റ്റും ഇല്ലാത്ത സൈറ്റുകൾ ഞങ്ങൾ പ്രദർശിപ്പിക്കും.
ജീനോം സീക്വൻസിംഗ് പകർച്ചവ്യാധി ഗവേഷണ മേഖലയെ പുനരുജ്ജീവിപ്പിച്ചു, രോഗ പകർച്ചവ്യാധിശാസ്ത്രം, രോഗകാരി, ഹോസ്റ്റ്-രോഗകാരി ഇടപെടലുകൾ, രോഗകാരികളിൽ അടിച്ചേൽപ്പിക്കുന്ന പരിണാമ പ്രക്രിയ എന്നിവ വെളിപ്പെടുത്തുന്നു. മൈകോബാക്ടീരിയം ട്യൂബർകുലോസിസ് കോംപ്ലക്സ് (എംടിബിസി) മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസിനെ അതിന്റെ മൃഗ അഡാപ്റ്റീവ് അംഗങ്ങളിൽ ഒന്നായി കണക്കാക്കുന്നു, ഇത് ഭൂമിയിലെ സസ്തനികളിൽ ക്ഷയരോഗത്തിന് (ടിബി) കാരണമാകുന്നു, കൂടാതെ ബാക്ടീരിയ പരിണാമത്തിന്റെ ഒരു സാധാരണ മാതൃകയുമാണ്. മറ്റ് എംടിബിസി അംഗങ്ങളെപ്പോലെ, മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസും കർശനമായി ക്ലോൺ ചെയ്തതും സാവധാനം വികസിച്ചുകൊണ്ടിരിക്കുന്നതുമായ ഒരു രോഗകാരിയാണെന്ന് അനുമാനിക്കപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ പുനഃസംയോജനത്തിന്റെയോ തിരശ്ചീന ജീൻ കൈമാറ്റത്തിന്റെയോ ഒരു ലക്ഷണവും ഇതിൽ ഇല്ല. ഈ കൃതിയിൽ, കന്നുകാലികളുടെ ജനിതക വൈവിധ്യത്തെക്കുറിച്ചുള്ള ഉൾക്കാഴ്ചകൾ നേടുന്നതിന് വ്യത്യസ്ത വംശാവലിയിൽ നിന്നുള്ള (യൂറോപ്പും ആഫ്രിക്കയും) നിന്നുള്ള 70 കന്നുകാലി എം. അടങ്ങിയ ഒരു മുഴുവൻ ജീനോം സീക്വൻസ് (ഡബ്ല്യുജിഎസ്) ഡാറ്റാസെറ്റിലേക്ക് ഞങ്ങൾ താരതമ്യ ജീനോമിക്സ് പ്രയോഗിക്കുന്നു. പരിണാമ ശക്തി. പുനഃസംഘടനയുടെ ലക്ഷണങ്ങൾ കണക്കാക്കാൻ മൂന്ന് വ്യത്യസ്ത രീതികൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു. ആഗോളതലത്തിൽ, ഉറച്ച പിന്തുണയോടെ രണ്ട് സ്വതന്ത്ര രീതികളിലൂടെ ഒരു ചെറിയ എണ്ണം പുനഃസംയോജന സംഭവങ്ങൾ തിരിച്ചറിയുകയും സ്ഥിരീകരിക്കുകയും ചെയ്തിട്ടുണ്ട്. എന്നിരുന്നാലും, മ്യൂട്ടേഷനുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, പുനഃസംയോജനം എം. ബോവിസിന്റെ വൈവിധ്യത്തിൽ ദുർബലമായ സ്വാധീനം ചെലുത്തുന്നു (മൊത്തത്തിൽ r/m = 0.037). ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റാ സെറ്റിൽ മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസിന്റെ ക്ലോണൽ കോംപ്ലക്സിൽ ലഭിച്ച r/m ശരാശരി വ്യത്യാസം, ഒരേ ടാക്സോണമിക് സ്പീഷീസുകളിലേക്ക് നിയുക്തമാക്കിയിരിക്കുന്ന വംശങ്ങൾക്കിടയിൽ പുനഃസംയോജനത്തിന്റെ അളവ് വളരെയധികം വ്യത്യാസപ്പെടാം എന്ന പൊതു ആശയവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. ഈ പ്രവർത്തനത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കി, മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസിലെ പുനഃസംയോജനം തള്ളിക്കളയാനാവില്ല, അതിനാൽ ഭാവിയിലെ താരതമ്യ ജീനോമിക്സ് ഗവേഷണത്തിൽ ഇത് കൂടുതൽ ശ്രമങ്ങൾക്ക് വിഷയമായിരിക്കണം, അതിൽ ലോകമെമ്പാടുമുള്ള വ്യത്യസ്ത എപ്പിഡെമിയോളജിക്കൽ സാഹചര്യങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള വലിയ ഡാറ്റ സെറ്റുകളുടെ WGS നിർണായകമാണ്. മൾട്ടി-ഹോസ്റ്റ് ടിബി വ്യാപനത്തിൽ നിന്നുള്ള ചെറിയ മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസ് ഡാറ്റാ സെറ്റിൽ (n = 42) ഒരു അധിക വിശകലനം നടത്തി, 1,800-ലധികം ലോക്കികളെ തിരിച്ചറിഞ്ഞു, അതിൽ കുറഞ്ഞത് ഒരു സ്ട്രെയിൻ ഒരൊറ്റ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് പോളിമോർഫിസം (SNP) കാണിച്ചു. മിക്കതും (87.1%) കോഡിംഗ് മേഖലയിലാണ് സ്ഥിതി ചെയ്യുന്നത്, കൂടാതെ പര്യായ മാറ്റങ്ങളുടെ ആഗോള അനുപാതം (dN/dS) 1.5 കവിയുന്നു, ഇത് പോസിറ്റീവ് സെലക്ഷൻ എം. ബോവിസിൽ ചെലുത്തുന്ന ഒരു പ്രധാന പരിണാമ ശക്തിയാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. "ലിപിഡ് മെറ്റബോളിസം", "സെൽ വാൾ, സെല്ലുലാർ പ്രക്രിയകൾ", "ഇന്റർമീഡിയറ്റ് മെറ്റബോളിസം, ശ്വസനം" എന്നീ പ്രവർത്തന വിഭാഗങ്ങളാൽ സമ്പന്നമായ ജീനുകളിൽ SNP-കളുടെ ഉയർന്ന അനുപാതം കണ്ടെത്തി, മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസിന്റെ പ്രാധാന്യത്തിന്റെ ജീവശാസ്ത്രത്തിലും പരിണാമത്തിലും അവയുടെ സാധ്യതകൾ വെളിപ്പെടുത്തുന്നു. MTBC പൂർവ്വികരിലെ ജീനുകളെ സൂക്ഷ്മമായി പരിശോധിക്കുമ്പോൾ, തിരശ്ചീന ജീൻ ട്രാൻസ്ഫറിന് സാധ്യതയുള്ളതും 3R (DNA റിപ്പയർ, റെപ്ലിക്കേഷൻ, റീകോമ്പിനേഷൻ) സിസ്റ്റത്തിൽ ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുള്ളതുമായ ടൈജിമയുടെ D ന്യൂട്രൽ ടെസ്റ്റിന്റെ ആഗോള ശരാശരി നെഗറ്റീവ് മൂല്യം വെളിപ്പെടുത്തുന്നു, ഇത് കഴിഞ്ഞ സെലക്ടീവ് സ്കാനിംഗിനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ജനസംഖ്യാ വികാസത്തിന് ശേഷമുള്ള സമീപകാല തടസ്സം ഇപ്പോഴും നിർബന്ധിത രോഗകാരിയായ മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസിനെ ഹോസ്റ്റിനെതിരെ പോരാടുന്നതിനുള്ള പ്രധാന പരിണാമ ചാലക ഘടകമാണ്.
മൈകോബാക്ടീരിയം ട്യൂബർക്കുലോസിസ് കോംപ്ലക്സ് (MTBC) ബാക്ടീരിയൽ രോഗകാരികളുടെ ഏറ്റവും വിജയകരമായ ഒരു വിഭാഗമാണ്, കൂടാതെ ബാക്ടീരിയൽ പരിണാമത്തിന്റെ ഒരു സാധാരണ കേസുമാണ്. ഇതിലെ അംഗങ്ങൾ ജീനോമിക് തലത്തിൽ (> 99%) 1,2 ൽ അതിശയകരമാംവിധം ഉയർന്ന ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് ഐഡന്റിറ്റി കാണിക്കുന്നു. വ്യത്യസ്ത MTBC ഇക്കോടൈപ്പുകൾ സൂക്ഷ്മ സസ്തനികൾ മുതൽ മനുഷ്യർ വരെയുള്ള വിവിധ ആതിഥേയ ഇനങ്ങളിൽ ഒരു പകർച്ചവ്യാധി ഗ്രാനുലോമാറ്റസ് രോഗമായ ക്ഷയരോഗത്തിന് (TB) കാരണമാകും3,4,5. നിലവിൽ, ഈ സമുച്ചയത്തിൽ മനുഷ്യരും [M. ട്യൂബർക്കുലോസിസ് (Mtb), മൈകോബാക്ടീരിയം ആഫ്രിക്കാനം] മൃഗങ്ങളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന രോഗകാരികളും (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" and "dassie") 5,6 ഉൾപ്പെടുന്നു. എം. കാനെറ്റി ("നോഡോബാക്റ്റർ ഗ്ലാബ്രറ്റ" എന്നും അറിയപ്പെടുന്നു) മുകളിൽ പറഞ്ഞ മൈകോബാക്ടീരിയയുമായുള്ള ശരാശരി ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് ഐഡന്റിറ്റി 98% ആണ്, താരതമ്യ ജീനോമിക്സ് പഠനങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത് എം. കാനെറ്റിയും എംടിബിസിയുടെ ബാക്കിയുള്ളവയും അടുത്തിടെ പൊതു പൂർവ്വികനിൽ നിന്ന് വ്യതിചലിച്ചു എന്നാണ്.7 ഈ ആശയം പരിഗണിക്കുമ്പോൾ, ചില എഴുത്തുകാർ എം. കാനെറ്റിയെ എംടിബിസി 8 അംഗം എന്ന് വിളിക്കുന്നു.
MTBC യെ ഒരു കർശനമായ ക്ലോണൽ കോംപ്ലക്സ് ആയി വ്യവസ്ഥാപിതമായി വിവരിക്കുന്നു, കൂടാതെ അതിന്റെ ജനസംഖ്യാ ഘടന വ്യക്തമായി നിയന്ത്രിക്കുന്നത് കുറഞ്ഞ വൈവിധ്യം, തടസ്സങ്ങൾ, സെലക്ടീവ് സ്കാനിംഗ്, ജനിതക വ്യതിയാനം എന്നിവയാണ്. 9,10. പോളിമോർഫിസങ്ങൾ നഷ്ടപ്പെട്ടത് പോലുള്ള സങ്കീർണ്ണമായ കർശനമായ ക്ലോണൽ പരിണാമം പുനഃസംയോജനത്തിലൂടെ പുനഃസ്ഥാപിക്കാൻ കഴിയില്ലെന്ന് കരുതുക. ഈ ആശയം അടിസ്ഥാനമാക്കി, ഡിഫറൻഷ്യൽ മേഖലയുടെയും (RD) TbD1 (Mtb നിർദ്ദിഷ്ട ഇല്ലാതാക്കൽ 1 മേഖല) യുടെയും ജീനോമിക് ഇല്ലാതാക്കലിന്റെ തുടർച്ചയായ സംഭവങ്ങൾ MTBC പരിണാമത്തിന്റെ തന്മാത്രാ മാർക്കറുകളായി നിർദ്ദേശിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. താരതമ്യ ജീനോമിക്സും മുഴുവൻ ജീനോം സീക്വൻസിംഗ് (WGS) പ്രവർത്തനവും മനുഷ്യ-അഡാപ്റ്റഡ് അംഗങ്ങളെ ഒമ്പത് ലൈനേജുകളായി വിഭജിക്കുന്നതിനെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു (മൈകോബാക്ടീരിയം ട്യൂബർകുലോസിസ് L1 മുതൽ L4, L7, L8; മൈകോബാക്ടീരിയം ആഫ്രിക്കാനം L5, L6, L9), ലൈനേജുകൾ L2 മുതൽ L4 വരെ പങ്കിട്ടു ഡിലീറ്റ് TbD1 മേഖല2,11,12,13. കൂടാതെ, മൃഗങ്ങളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന അംഗങ്ങൾ ഒരു പൊതു പൂർവ്വികനെ പങ്കിടാൻ നിർദ്ദേശിക്കപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, ഇത് RD7, RD8, RD9, RD102, 5, 14 എന്നിവയിലെ ക്ലേഡ്-നിർദ്ദിഷ്ട ഇല്ലാതാക്കലുകളാൽ നിർവചിക്കപ്പെടുന്നു.
MTBC അംഗത്തിന്റെ വ്യത്യസ്ത ചരിത്രത്തിന് പകരം, തിരശ്ചീന ജീൻ ട്രാൻസ്ഫർ (HGT), പുനഃസംയോജന സംഭവങ്ങൾ അപൂർവമായി കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു, MTBC യുടെ പൂർവ്വികരിൽ സംഭവിക്കുന്നു15,16,17. ഹ്യൂസും സഹകാരികളും (2002), ഗുട്ടാക്കറും സഹകാരികളും (2006) എന്നിവരുടെ രണ്ട് ആദ്യകാല റിപ്പോർട്ടുകൾ, M. ട്യൂബർക്കുലോസിസ് സ്ട്രെയിനുകളിൽ പ്രത്യേക സ്ഥാനങ്ങൾ അടയാളപ്പെടുത്തുന്ന പോളിമോർഫിസങ്ങൾ രൂപപ്പെടുത്താൻ പുനഃസംയോജന സംഭവങ്ങൾ സഹായിച്ചേക്കാമെന്ന് അഭിപ്രായപ്പെട്ടു18,19. MTBC യിൽ പുനഃസംയോജനത്തിന്റെ വ്യക്തമായ അഭാവത്തിനുള്ള കാരണങ്ങൾ ഇവയാണ്: (1) HGT യുടെ മെക്കാനിക്കൽ പ്രക്രിയയും ശേഷി നഷ്ടപ്പെടലും; (2) HGT സംഭവങ്ങളുടെ അപൂർവത; (3) MTBC niche ൽ പുനഃസംയോജന സംഭവങ്ങൾക്ക് സാധ്യതയില്ല14,17. അടുത്തിടെ, MTBC സ്ട്രെയിൻ 20, മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസ് 21 എന്നിവയിൽ പ്രയോഗിച്ച ചില മുഴുവൻ-ജീനോം സീക്വൻസിംഗ് (WGS) പഠനങ്ങൾ പുനഃസംയോജനത്തിന്റെ തെളിവുകൾ നൽകിയിട്ടുണ്ട്, MTBC സ്ട്രെയിനുകൾ പലപ്പോഴും ചെറിയ DNA ശകലങ്ങൾ കൈമാറ്റം ചെയ്യുന്നുവെന്ന് ആദ്യം കാണിച്ചത്, എന്നാൽ പരിമിതമായ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് ശ്രേണി വ്യതിയാനം കാരണം, ഈ സംഭവങ്ങൾ ഇപ്പോഴും ശ്രദ്ധയിൽപ്പെട്ടിട്ടില്ല.
കന്നുകാലികളിൽ (പ്രധാനമായും കന്നുകാലികളിൽ) നിന്ന് ഏറ്റവും സാധാരണയായി വീണ്ടെടുക്കപ്പെടുന്ന MTBC അംഗമാണ് മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസ്, എന്നിരുന്നാലും സ്വതന്ത്രമായി സഞ്ചരിക്കുന്നതും വേലി കെട്ടിയതുമായ വന്യമൃഗങ്ങളിൽ നിന്നും ഇതിനെ വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ കഴിയും4,22,23,24. സ്പോളിഗോടൈപ്പിംഗ് പ്രൊഫൈൽ, നിർദ്ദിഷ്ട ഇല്ലാതാക്കലുകൾ, പ്രത്യേക ജീനുകളിലെ സിംഗിൾ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് പോളിമോർഫിസങ്ങൾ (SNP-കൾ) 25, 26, 27, 28, 29 എന്നിവ അനുസരിച്ച്, എം. ബോവിസ് അഞ്ച് പ്രധാന ക്ലോണൽ കോംപ്ലക്സുകളായി പരിണമിച്ചു [യൂറോപ്യൻ 1 (Eu1), യൂറോപ്യൻ 2 (Eu2), യൂറോപ്യൻ 3 (Eu3), ആഫ്രിക്കൻ 1 (Af1), ആഫ്രിക്ക 2 (Af2)]. ഈ ക്ലോണൽ കോംപ്ലക്സുകൾ മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസ് ജനസംഖ്യയുടെ വൈവിധ്യമാർന്ന ഘടനയും ഭൂമിശാസ്ത്രപരമായ പ്രദേശങ്ങളുമായുള്ള അതിന്റെ ബന്ധവും പ്രകടമാക്കുന്നു. കൂടാതെ, സിമ്പലും സഹകാരികളും നടത്തിയ സമീപകാല WGS പ്രവർത്തനങ്ങൾ (2020) 1,900-ലധികം ജീനോമുകളുള്ള മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസിന്റെ SNP അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഒരു ഫൈലോജെനി രൂപകൽപ്പന ചെയ്തു, ഇത് കുറഞ്ഞത് നാല് വ്യത്യസ്ത വംശങ്ങളെങ്കിലും (Lb1 മുതൽ Lb1 മുതൽ Lb4 വരെ എന്ന് പേരിട്ടിരിക്കുന്നു) ഉണ്ടെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു, അവ മുമ്പ് നിർവചിച്ച ക്ലോണൽ കോംപ്ലക്സുമായി പൂർണ്ണമായും പൊരുത്തപ്പെടുന്നില്ല, എന്നിരുന്നാലും ഭൂമിശാസ്ത്രപരമായ പ്രത്യേകതയും സ്ഥിരീകരിക്കാൻ കഴിയും30. ഈ രചയിതാക്കൾ ഫൈലോജെനിയുടെയും തന്മാത്രാ ഡേറ്റിംഗിന്റെയും വ്യത്യസ്ത വിശകലനം നടത്തി, പക്ഷേ പുനഃസംയോജനം പഠിച്ചില്ല30.
സ്പോളിഗോടൈപ്പിംഗ്, MIRU-VNTR (മൈകോബാക്ടീരിയൽ ഇന്റർസ്‌പെഴ്‌സ്ഡ് റിപ്പീറ്റ് യൂണിറ്റ്-വേരിയബിൾ ടാൻഡം റിപ്പീറ്റ് നമ്പർ), സമീപകാല SNP ടൈപ്പിംഗ് തുടങ്ങിയ വ്യത്യസ്ത തന്മാത്രാ സാങ്കേതിക വിദ്യകൾ ഉപയോഗിച്ചുള്ള മുൻകാല പ്രവർത്തനങ്ങൾ M. bovis സ്ട്രെയിനുകൾ 31,32,33, 34,35 എന്നിവയിൽ ഒരു നിശ്ചിത തലത്തിലുള്ള ജനിതക വൈവിധ്യം വെളിപ്പെടുത്തി. രോഗ എപ്പിഡെമിയോളജി പഠനത്തിൽ ജനിതക വ്യതിയാനത്തിന്റെ വ്യത്യാസം ഒരു പ്രധാന ഉപകരണമായി മാറിയിരിക്കുന്നു, ഇത് രോഗകാരി, വൈറൽസ്, രോഗ സംക്രമണം എന്നിവയെക്കുറിച്ച് ആഴത്തിൽ മനസ്സിലാക്കാൻ സഹായകമാണ്. വ്യത്യസ്ത ഹോസ്റ്റുകളുമായും എപ്പിഡെമിയോളജിക്കൽ സാഹചര്യങ്ങളുമായും പൊരുത്തപ്പെടലിന്റെയും സ്ഥിരതയുടെയും പ്രക്രിയയിൽ മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസ് ജീനോം ചുമത്തിയ പരിണാമപരമായ പ്രേരക ഘടകങ്ങൾ വെളിപ്പെടുത്താനുള്ള സാധ്യത WGS രീതിയുടെ ആവിർഭാവം നൽകുന്നു.
ഈ കൃതിയിൽ, മൈകോപ്ലാസ്മ ബോവിസിന്റെ പരിണാമ പ്രക്രിയയെക്കുറിച്ചുള്ള ഉൾക്കാഴ്ചകൾ നേടുന്നതിന്, പ്രത്യേകിച്ച് ഫൈലോജെനെറ്റിക് ബന്ധങ്ങളും പുനഃസംയോജന സംഭവങ്ങളും പരിഹരിക്കുന്നതിന്, വിവിധ മൈകോപ്ലാസ്മ ബോവിസ് ഡാറ്റാസെറ്റുകളിൽ (n=70) താരതമ്യ ജീനോമിക് വിശകലനം ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു. ഈ വിശകലനത്തിന് ഒരു അനുബന്ധമായി, പോർച്ചുഗലിലെ 31,36 ലെ നന്നായി സ്വഭാവസവിശേഷതകളുള്ള മൾട്ടി-ഹോസ്റ്റ് ക്ഷയരോഗ മേഖലയിൽ നിന്ന് ലഭിച്ച എം. ബോവിസ് ഐസൊലേറ്റുകളുടെ (n=42) ഒരു ഉപ-ഡാറ്റ സെറ്റ് നോൺ-ഐഡന്റിറ്റി അനുമാനിക്കാൻ കൂടുതൽ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്തു. സെൻസ് (dN) പര്യായപദ (dS) ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് പകരക്കാരുമായുള്ള ആപേക്ഷിക അനുപാതവും സാഹിത്യത്തിൽ പരാമർശിച്ചിരിക്കുന്ന നിർദ്ദിഷ്ട ജീനോമുകളുടെ പരിണാമ സംഭാവനയും തമ്മിലുള്ള സന്തുലിതാവസ്ഥ, അവ 37,38 MTBC പൂർവ്വികർ HGT വഴി നേടിയതാണ്, കൂടാതെ 3R (DNA നന്നാക്കൽ, പകർപ്പെടുക്കൽ, പുനഃസംയോജനം) സിസ്റ്റം ജീൻ ഘടകങ്ങൾ 39 എൻകോഡ് ചെയ്യുന്നു. പുരാതന പോളിമോർഫിസങ്ങളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നതിനാൽ HGT വഴി ലഭിച്ച ജീനുകൾ തിരഞ്ഞെടുക്കുക, അതിനാൽ അവയിൽ പര്യായപദ മാറ്റങ്ങളുടെ ഉയർന്ന അനുപാതം അടങ്ങിയിരിക്കാമെന്ന് പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു. എം. ട്യൂബർക്കുലോസിസ് സ്ട്രെയിനുകളെക്കുറിച്ചുള്ള മുൻകാല പ്രവർത്തനങ്ങൾ ഈ ജീനുകളിൽ പ്രവർത്തിക്കുന്ന പൊതുവായ നെഗറ്റീവ്/ശുദ്ധീകരണ തിരഞ്ഞെടുപ്പുകളെ സൂചിപ്പിച്ചതിനാലാണ് 3R സിസ്റ്റത്തിൽ ഉൾപ്പെടുത്തിയ ജീനുകൾ തിരഞ്ഞെടുത്തത്, കൂടാതെ അവ പരിണാമത്തിൽ ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിച്ചേക്കാം 39. പുനഃസംഘടന സംഭവങ്ങളുടെ നിലനിൽപ്പ് അനുമാനിക്കുക എന്നതാണ് ഈ പഠനത്തിന്റെ മറ്റൊരു ലക്ഷ്യം. ഇക്കാരണത്താൽ, പോർച്ചുഗലിൽ നിന്നുള്ള ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റാസെറ്റിൽ യൂറോപ്യൻ ക്ലോൺ കോംപ്ലക്സ് 2 ന്റെയും ക്ലോൺ കോംപ്ലക്സ് നൽകിയിട്ടില്ലാത്ത സ്ട്രെയിനുകളുടെയും ജീനോമുകൾ മാത്രമേ അടങ്ങിയിട്ടുള്ളൂ എന്നതിനാൽ, എല്ലാ ക്ലോൺ കോംപ്ലക്സുകളുടെയും പ്രതിനിധിയെ ഒടുവിൽ നേടുന്നതിനും ഫലങ്ങളുടെ ദൃഢതയും വ്യാപ്തിയും മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിനും പൊതുവായി ലഭ്യമായ ജീനോം ഡാറ്റ ഉൾപ്പെടുത്താൻ ഞങ്ങൾ തീരുമാനിച്ചു.
പോർച്ചുഗീസ് എൻഡെമിക് മൾട്ടി-ഹോസ്റ്റ് ട്യൂബർക്കുലോസിസ് രംഗത്ത് നിന്നുള്ള 42 പുതുതായി ക്രമീകരിച്ച മൈകോപ്ലാസ്മ ബോവിസ് ജീനോമുകൾ (വിശദാംശങ്ങൾ താഴെ കൊടുത്തിരിക്കുന്നു), മുമ്പ് ഒരു എപ്പിഡെമിയോളജിക്കൽ വീക്ഷണകോണിൽ നിന്ന് വിശേഷിപ്പിക്കപ്പെട്ടവയാണ്36, ഈ കൃതിയുടെ കേന്ദ്രബിന്ദു. പോർച്ചുഗലിൽ നിന്നുള്ള ഡാറ്റാ സെറ്റിൽ യൂറോപ്യൻ 2 ക്ലോൺ കോംപ്ലക്സുകളുടെയും നിയുക്ത കോംപ്ലക്സുകളില്ലാത്ത സ്ട്രെയിനുകളുടെയും പ്രതിനിധികൾ മാത്രമേ ഉള്ളൂ എന്നതിനാൽ, എം. ബോവിസ് ക്ലോൺ കോംപ്ലക്സുകളുടെ എല്ലാ പ്രതിനിധികളും ഉൾപ്പെടുന്ന ഡാറ്റാ സെറ്റ് വികസിപ്പിക്കുന്നതിന് പൊതുവായി ലഭ്യമായ മുഴുവൻ-ജീനോം സീക്വൻസിംഗ് ഡാറ്റ ചേർത്തിട്ടുണ്ട്. അതിനാൽ, ഈ കൃതിയിൽ മൂന്ന് മുഴുവൻ-ജീനോം സീക്വൻസിംഗ് ഡാറ്റ സ്രോതസ്സുകൾ ഉപയോഗിച്ചു: പൂർണ്ണമായ/ഡ്രാഫ്റ്റ് ജീനോം അസംബ്ലി, എൻ‌സി‌ബി‌ഐയിൽ (നാഷണൽ സെന്റർ ഫോർ ബയോടെക്നോളജി ഇൻഫർമേഷൻ) സംഭരിച്ചിരിക്കുന്ന 10 സ്കാഫോൾഡുകൾ വരെ (n = 15 ഐസൊലേറ്റുകൾ); എസ്‌ആർ‌എയിൽ സംഭരിച്ചിരിക്കുന്നു (സീക്വൻസ് റീഡ് ആർക്കൈവിന്റെ ഇല്ലുമിന ഫാസ്റ്റ്ക് ഫയൽ) എം. ബോവിസ് ക്ലോണുകളുടെ സങ്കീർണ്ണ വൈവിധ്യത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു (n = 12 ഐസൊലേറ്റുകൾ)30; പോർച്ചുഗലിൽ നിന്നുള്ള പുതുതായി ക്രമീകരിച്ച 42 ജീനോമുകൾ. മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസ് ബിസിജി (ബാസിൽ കാൽമെറ്റ്-ഗുറിൻ) എൻ‌സി‌ബി‌ഐ തിരയലിൽ നിന്ന് ഒഴിവാക്കി. M. bovis AF2122/97 സാധാരണയായി ഡാറ്റാസെറ്റിൽ ഉൾപ്പെടുത്തുന്നതിനായി ഒരു റഫറൻസ് ജീനോമായി ഉപയോഗിക്കുന്നു. ആഫ്രിക്കൻ 1 ക്ലോണിംഗ് കോംപ്ലക്സ് പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന മുഴുവൻ ജീനോം ശ്രേണിയുടെയും പൊതുജന ലഭ്യതക്കുറവും, Af2, Eu1 എന്നിവയുടെ പ്രതിനിധി സ്ട്രെയിനുകളിൽ നിന്നുള്ള ചെറിയ എണ്ണം ജീനോമുകളും കാരണം, SRA നൽകിയ യഥാർത്ഥ സീക്വൻസിംഗ് ഡാറ്റ ഈ സന്ദർഭങ്ങളിൽ ഉപയോഗിച്ചു. സിമ്പലിന്റെയും അദ്ദേഹത്തിന്റെ സഹകാരികളുടെയും പ്രവർത്തനം (2020) മുകളിൽ പറഞ്ഞ ക്ലോണിംഗ് കോംപ്ലക്സിൽ നിന്ന് ജീനോം തിരിച്ചറിയാൻ സഹായിച്ചു, കൂടാതെ ഡാറ്റാ സെറ്റിൽ ഉൾപ്പെടുത്തുന്നതിനായി മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസ് തിരഞ്ഞെടുക്കാൻ സഹായിച്ചു. Eu3-ന്, ഒരു തരം ജീനോം മാത്രമേ വിവരിച്ചിട്ടുള്ളൂ (Branger et al., 2020), അതിനാൽ ഞങ്ങൾ ഉൾപ്പെടുത്തുന്ന ജീനോം Eu3 സമുച്ചയത്തിന്റെ ഒരു പ്രത്യേക പ്രതിനിധിയാണ്.
ആഗോളതലത്തിൽ, ഈ ഡാറ്റാ സെറ്റിൽ 1985 മുതൽ 2016 വരെ 12 രാജ്യങ്ങളിലായി വിതരണം ചെയ്ത 8 ഹോസ്റ്റ് സ്പീഷീസുകളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത 70 കന്നുകാലി എം. ബോവികൾ ഉൾപ്പെടുന്നു. 36 സ്പീഷീസുകളെ Eu2 എന്നും, 7 സ്പീഷീസുകൾ Eu1 എന്നും, 1 സ്പീഷീസ് Eu3 എന്നും, 3 സ്പീഷീസുകൾ Af1 എന്നും, 4 സ്പീഷീസുകൾ Af2 എന്നും, 19 സ്പീഷീസുകൾ ഏതെങ്കിലും ക്ലോണൽ കോംപ്ലക്സിന് (വിശദാംശങ്ങൾ താഴെ) ആട്രിബ്യൂട്ട് ചെയ്യാൻ കഴിയില്ല എന്നും നിയുക്തമാക്കിയിരിക്കുന്നു. ഈ പഠനത്തിൽ ഉപയോഗിച്ചിരിക്കുന്ന മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസിന്റെ വിശദമായ വിവരങ്ങൾ (ആക്സഷൻ നമ്പർ ഉൾപ്പെടെ) പട്ടിക 1 ലും അനുബന്ധ പട്ടിക 1 ലും കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.
പോർച്ചുഗലിലെ മൃഗ ക്ഷയരോഗ ഹോട്ട്‌സ്‌പോട്ടുകളിൽ നിന്ന് 12 വർഷത്തിലേറെയായി വിതരണം ചെയ്ത മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസിന്റെ പുതുതായി ക്രമീകരിച്ച 42 മുഴുവൻ ജീനോമുകളാണ് ഈ പഠനത്തിന്റെ കേന്ദ്രം, കാരണം സാധ്യതയുള്ള വന്യജീവി-കന്നുകാലി രോഗ സംവിധാനങ്ങൾ പതിവായി നിരീക്ഷിച്ചിട്ടുണ്ട് 31,36 (അനുബന്ധ ചിത്രം 1). തുടർന്നുള്ള നടപടിക്രമങ്ങൾ അനുസരിച്ച്, 2003 മുതൽ 2015 വരെ കന്നുകാലികൾ (n = 14), ചുവന്ന മാൻ (n = 16), കാട്ടുപന്നി (n = 12) എന്നിവയിൽ നിന്ന് ഈ ഇനങ്ങൾ വേർതിരിച്ചു: ശുപാർശ ചെയ്യുന്ന പ്രോട്ടോക്കോൾ മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസൃതമായി മൃഗങ്ങളെ ശേഖരിച്ച് കൈകാര്യം ചെയ്യുക. ടിഷ്യു സാമ്പിളുകൾ OIE ടെറസ്ട്രിയൽ ആനിമൽ ഹാൻഡ്‌ബുക്കിലുണ്ട്, അവ സ്റ്റോൺബ്രിങ്ക്, ലോവൻസ്റ്റീൻ-ജെൻസൺ പൈറുവേറ്റ് ഖര മാധ്യമത്തിലും ദ്രാവക മാധ്യമത്തിലും കുത്തിവയ്ക്കുന്നു. സംസ്കാരങ്ങൾ 37 °C ൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ആഴ്ചയിൽ ഒരിക്കൽ കുറഞ്ഞത് 12 ആഴ്ചത്തേക്ക് വളർച്ച പരിശോധിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. കോളനികൾ നേരിട്ട് -80ºC താപനിലയിൽ ഗ്ലിസറോൾ ലായനിയിൽ സൂക്ഷിക്കുന്നു. മൈകോബാക്ടീരിയം സെലക്ടീവ് മീഡിയത്തിൽ (മിഡിൽബ്രൂക്ക് 7H9, BD ഡയഗ്നോസ്റ്റിക്സ്), WGS പ്രോഗ്രാമിന്റെ DNA ലഭിക്കുന്നതിനായി യഥാർത്ഥ ആർക്കൈവ് ചെയ്ത സാമ്പിളുകൾ ഒരു സിംഗിൾ ഇൻ വിട്രോ പാസേജ് ഇൻ വിട്രോയിലൂടെ കടത്തിവിട്ടു. ഇതിനായി, മിഡിൽബ്രൂക്ക് 7H9-ൽ 37°C റീട്രെയിനിൽ 5% സോഡിയം പൈറുവേറ്റ്, 10% ADS (50 ഗ്രാം ആൽബുമിൻ, 20 ഗ്രാം ഗ്ലൂക്കോസ്, 8.5 ഗ്രാം സോഡിയം ക്ലോറൈഡ് 1 ലിറ്റർ വെള്ളത്തിൽ) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഫ്രോസൺ കൾച്ചർ സ്റ്റോക്ക് ലായനി സമ്പുഷ്ടമാക്കി. 4 ആഴ്ച വളർച്ചയ്ക്ക് ശേഷം, മീഡിയം പുതുക്കുകയും വളർച്ച നിരീക്ഷിക്കുന്നതുവരെ കൾച്ചർ പതിവായി നിരീക്ഷിക്കുകയും ചെയ്തു. സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി കോശങ്ങൾ വിളവെടുത്തു, പെല്ലറ്റ് 500 µL ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫേർഡ് സലൈൻ (PBS) ൽ വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്തു, 99 °C-ൽ 30 മിനിറ്റ് ചൂടാക്കി, സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു, സൂപ്പർനേറ്റന്റ് -20 °C-ൽ WGS വരെ സൂക്ഷിച്ചു. എല്ലാ നടപടിക്രമങ്ങളും ലെവൽ 3 ബയോസേഫ്റ്റി സൗകര്യങ്ങളിലാണ് നടത്തുന്നത്.
ഓരോ ഡിഎൻഎ സാമ്പിളിന്റെയും തനതായ സൂചിക ഉപയോഗിച്ചാണ് WGS പെയർ-എൻഡ് ജീനോം ലൈബ്രറി തയ്യാറാക്കുന്നത്, കൂടാതെ സീക്വൻസിംഗിനായി ഇല്ലുമിന മിസെക് (2 × 250 പിബി) (40 സാമ്പിളുകൾ), ഹൈസെക് (2 × 150 പിബി) (രണ്ട് ഐസൊലേറ്റുകൾ) സാങ്കേതികവിദ്യ (യൂറോഫിൻസ് ജീനോമിക്സ്, ജർമ്മനി) എന്നിവ ഉപയോഗിക്കുന്നു. നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ അനുസരിച്ച്, ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ സീക്വൻസ് ചെയ്യുന്നതിന് ഡബിൾ-എൻഡ് മൊഡ്യൂൾ അറ്റാച്ച്മെന്റുള്ള ഇല്ലുമിന ജീനോം അനലൈസർ ഉപയോഗിക്കുക, ലൈബ്രറി നിർമ്മിക്കാൻ ഇല്ലുമിനയിൽ നിന്നുള്ള നെക്സ്റ്റെറ എക്സ് ടി ഡിഎൻഎ ലൈബ്രറി പ്രെപ്പ് കിറ്റ് ഉപയോഗിക്കുക.
SRA (n = 12) ൽ നിന്ന് വീണ്ടെടുത്ത ഡാറ്റ കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, ക്ലോൺ കോംപ്ലക്സിന്റെ തിരിച്ചറിയൽ അനുബന്ധ പ്രസിദ്ധീകരണമായ 30, 41, 43 ന്റെ മെറ്റാഡാറ്റയായി ഉപയോഗിക്കാം. മൈക്കോബാക്ടീരിയം ബോവിസ് AF2122/97, മൈക്കോബാക്ടീരിയം ബോവിസ് 3601 എന്നിവ ഒഴികെയുള്ള പൂർണ്ണ ജീനോം പരിഗണിക്കുമ്പോൾ, യഥാക്രമം Eu1, Eu3 ക്ലോണൽ കോംപ്ലക്സ് 25, 29 എന്നിവയുടെ അംഗീകൃത അംഗങ്ങളായ മൈക്കോബാക്ടീരിയം ട്യൂബർക്കുലോസിസ് H37Rv (NCBI ആക്‌സഷൻ നമ്പർ NC_000962.3) യുടെ പൂർണ്ണ ജീനോമിന് സമാനമാണ്. MAFFT (അമിനോ ആസിഡ് അല്ലെങ്കിൽ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് സീക്വൻസിന്റെ മൾട്ടിപ്പിൾ അലൈൻമെന്റ് പ്രോഗ്രാം, പതിപ്പ് 7.458), പാരാമീറ്റർ -addfragments48 എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചാണ് ജീനോം വിന്യാസം നടത്തുന്നത്. തുടർന്ന്, വ്യത്യസ്ത ക്ലോണൽ കോംപ്ലക്സുകളുടെ അഭാവവും/അല്ലെങ്കിൽ SNP സവിശേഷതകളുടെ സാന്നിധ്യവും തിരയുക.
പുതുതായി ക്രമീകരിച്ച മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസും (n = 42) അസംബിൾ ചെയ്ത ജീനോം ഡ്രാഫ്റ്റിന്റെ യഥാർത്ഥ റീഡുകളും (n = 3) vSNP പൈപ്പ്‌ലൈനിലൂടെയും വ്യത്യസ്ത ക്ലോണുകളുടെ ഇല്ലാതാക്കലിന്റെയും/അല്ലെങ്കിൽ SNP സവിശേഷതകളുടെയും സാന്നിധ്യത്തിലൂടെയും കോംപ്ലക്‌സിനെ റഫറൻസ് ജീനോമായ മൈകോബാക്ടീരിയം ട്യൂബർക്കുലോസിസ് H37Rv-യുമായി വിന്യസിക്കുന്നു. ഒരു തിരയൽ നടത്തി.
അനുബന്ധ ക്ലോണൽ കോംപ്ലക്സിലേക്ക് ജീനോമിക് ഡാറ്റ നൽകുന്നതിന്, സവിശേഷതകളുടെ അഭാവം, കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ SNP, സ്പോളിഗോടൈപ്പിംഗ് പ്രൊഫൈലുകളുടെ സാന്നിധ്യം/അഭാവം എന്നിവയിൽ നിന്ന് വിവരങ്ങൾ ശേഖരിക്കുക. നാല് ഡ്രാഫ്റ്റ് അസംബ്ലികൾക്കും, സ്പോളിഗോടൈപ്പിംഗ് പ്രൊഫൈൽ അനുമാനിക്കാൻ കഴിയില്ല, അതിനാൽ അവയെ "സങ്കീർണ്ണതയില്ല" ഗ്രൂപ്പിൽ ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്.
ഈ കൃതിയെ തുടർന്ന് വരുന്ന ബയോഇൻഫോർമാറ്റിക്സ് വർക്ക്ഫ്ലോ, ഡി നോവോ അസംബ്ലിയിൽ നിന്നും മാപ്പിംഗിൽ നിന്നും ഒരു റഫറൻസ് തന്ത്രത്തിലേക്ക് ആരംഭിക്കുന്നു, പുനഃസംയോജന സംഭവങ്ങളും നിർദ്ദിഷ്ട ജീനോം പോളിമോർഫിസങ്ങളും പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യുക എന്ന ലക്ഷ്യത്തോടെ. ചിത്രം 1 പിന്തുടരുന്ന ഘട്ടങ്ങളുടെ ഒരു ഫ്ലോചാർട്ട് നൽകുന്നു. പുനഃസംയോജന വിശകലനത്തിനായി, എല്ലാ ജീനോമുകളും അനുമാനങ്ങളുടെയും അനുബന്ധ സൂചകങ്ങളുടെയും കരുത്ത് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് ഉപയോഗിക്കുന്നു.
ജീനോം കൺസെൻസസ് സീക്വൻസുകളുടെ ജനറേഷനിലെ പിശകുകൾ കുറയ്ക്കുന്നതിന്, ഞങ്ങൾ ആദ്യം ഡി നോവോ അസംബ്ലി നേടി, തുടർന്ന് കോർ മൾട്ടിപ്പിൾ അലൈൻമെന്റുകൾ നേടി. യൂണിസൈക്ലർ പൈപ്പ്‌ലൈൻ നിലവിൽ https://github.com/rrwick/Unicycler49 ൽ ലഭ്യമാണ്, കൂടാതെ 54 സീക്വൻസ്ഡ് ജീനോമുകളുടെ (42 പുതുതായി സീക്വൻസ്ഡ്, 12 ഫാസ്റ്റ്ക് ഫയലുകൾ SRA-യിൽ നിന്ന് വീണ്ടെടുത്തു) ഡി നോവോ അസംബ്ലി നടത്താൻ ഇത് ഉപയോഗിക്കുന്നു. ചുരുക്കത്തിൽ, ആദ്യം മുതൽ കൂട്ടിച്ചേർക്കുന്നതിന് മുമ്പ്, FastQC പതിപ്പ് 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC), ട്രിമ്മോമാറ്റിക് പതിപ്പ് 0.36 ("cutting Adapters and other lighting-specific sequences from reads", "Cut bases from the end from the read, if the threshold quality 20" എന്നിവ പ്രയോഗിക്കുന്നു) എന്നിവയിൽ റീഡ് ക്വാളിറ്റി വിശകലനം നടത്തി. തുടർന്ന്, ജീനോം അസംബ്ലിക്ക് SPAdes optimiser49 ഉപയോഗിച്ചു, പോസ്റ്റ്-അസംബ്ലി ഒപ്റ്റിമൈസേഷനായി Pilon പതിപ്പ് 1.1851 ഉപയോഗിച്ചു. തെറ്റായ അസംബ്ലി ഒഴിവാക്കാൻ ഒരു യാഥാസ്ഥിതിക ബ്രിഡ്ജിംഗ് മോഡ് തിരഞ്ഞെടുത്തു, കൂടാതെ k-mer വലുപ്പം തിരഞ്ഞുപിടിച്ച് റീഡ് ലെങ്ത്തിന്റെ 20% നും 95% നും ഇടയിൽ തിരഞ്ഞെടുത്തു. SPAdes മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശങ്ങൾ പാലിക്കുകയും റീഡ് സൈസ് പരിഗണിക്കുകയും, 300 bp-യിൽ താഴെയുള്ള കോണ്ടിഗുകൾ ഇല്ലാതാക്കുകയും, 52 എന്ന 20 റീഡ് ഡെപ്ത് കവറേജ് കട്ട്ഓഫ് സ്ഥാപിക്കുകയും ചെയ്യുക. ഡി നോവോ അസംബ്ലി തന്ത്രത്തിൽ, ഉയർന്ന ആവർത്തന സ്വഭാവമുള്ള പ്രോലൈൻ-ഗ്ലൂട്ടാമേറ്റ് (PE), പ്രോലൈൻ-പ്രൊലൈൻ ഗ്ലൂട്ടാമേറ്റ് (PPE) പാരലോഗുകൾ പോലുള്ള ജീനോമിക് മേഖലകൾ നീക്കം ചെയ്തില്ല.
ഡി നോവോ അസംബ്ലിയുടെ ഗുണനിലവാരം വിലയിരുത്തുന്നത് QUAST പൈപ്പ്‌ലൈൻ (http://quast.sourceforge.net/quast.html) വഴിയാണ്, ഇത് കോണ്ടിഗിന്റെയും M. bovis AF2122/97 റഫറൻസ് ജീനോമിന്റെയും (NCBI ആക്‌സഷൻ നമ്പർ LT708304.1) പുതുക്കൽ സുഗമമാക്കുന്നു (ഗുണനിലവാര പാരാമീറ്ററുകൾക്കായി അനുബന്ധ പട്ടിക 1 കാണുക).
vSNP പൈപ്പ്‌ലൈനിന്റെ (https://github.com/USDA-VS/vSNP) സഹായത്തോടെ, ഇല്ലുമിന സീക്വൻസിംഗിൽ നിന്ന് പുതുതായി ക്രമീകരിച്ച M. bovis ന്റെ FASTQ ഫയൽ, M. bovis AF2122/97 റഫറൻസ് ജീനോമുമായി (LT708304.1) താരതമ്യം ചെയ്യുന്നു. ജീനോം അനാലിസിസ് ടൂൾകിറ്റ് (GATK) 53, 54, 55 ന്റെ മികച്ച പ്രാക്ടീസ് ശുപാർശകൾ അനുസരിച്ച്, റീകാലിബ്രേഷനായി സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഫിൽട്ടർ പാരാമീറ്ററുകൾ അല്ലെങ്കിൽ വേരിയന്റ് മാസ് സ്കോറുകൾ പ്രയോഗിക്കുന്നു. ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ SAMtools മാസ് സ്കോർ 150 ഉം AC = 2 ഉം ഉപയോഗിച്ച് ഫലങ്ങൾ ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുന്നു. മലിനീകരണം ഒഴിവാക്കാൻ റീഡിംഗുകൾ പരിശോധിക്കാൻ ക്രാക്കനും (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) ഉപയോഗിക്കുക. ഞങ്ങളുടെ ജോലിയിൽ ക്രമപ്പെടുത്തൽ തന്ത്രങ്ങൾ മാപ്പ് ചെയ്യാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന vSNP പൈപ്പ്‌ലൈൻ നിർവചിക്കപ്പെട്ട SNP-കളുടെയും ലക്ഷ്യങ്ങളുടെയും ഒരു പരമ്പര പരിശോധിക്കുന്നു, കൂടാതെ മിശ്രിത അണുബാധ സാഹചര്യങ്ങളും ഒഴിവാക്കുന്നു. റീഡ് ജീനോം കവറേജ് 99% നേക്കാൾ മികച്ചതാണ് (സപ്ലിമെന്ററി പട്ടിക 1).
മാപ്പിംഗ് പിശകുകളും തെറ്റായ SNP-കളും ഒഴിവാക്കാൻ, ഇനിപ്പറയുന്ന സന്ദർഭങ്ങളിൽ ഒരു വകഭേദം ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുക: (1) 20-ൽ താഴെ റീഡിംഗുകൾ ഇതിനെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു, (2) 0.9-ൽ താഴെ ആവൃത്തിയിൽ ഇത് കാണപ്പെടുന്നു, (3) കുറഞ്ഞത് ഒരു സ്ട്രെയിനിലെങ്കിലും ഇത് കാണപ്പെടുന്നു, പക്ഷേ കുറഞ്ഞത് മറ്റൊരു സ്ട്രെയിനിൽ വിടവുകളെങ്കിലും ഉണ്ട്. ഇന്റഗ്രേറ്റഡ് ജീനോമിക്സ് വ്യൂവർ (IGV) പതിപ്പ് 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 മാപ്പിംഗ് അല്ലെങ്കിൽ അലൈൻമെന്റ് പ്രശ്നങ്ങളുള്ള SNP-കളും സ്ഥാനങ്ങളും ദൃശ്യപരമായി പരിശോധിക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചു. പ്രോലൈൻ-ഗ്ലൂട്ടാമേറ്റ് (PE), പ്രോലൈൻ-പ്രൊലൈൻ ഗ്ലൂട്ടാമേറ്റ് (PPE) ജീനുകൾ വളരെ തനിപ്പകർപ്പായതും ഒരു മൾട്ടി-ജീൻ കുടുംബത്തിന്റെ ഭാഗമായതുമായതിനാൽ, ഇല്ലുമിന സീക്വൻസിംഗും മിസ്മാപ്പിംഗും വഴി അവ എളുപ്പത്തിൽ തെറ്റിദ്ധരിക്കപ്പെടുന്നു, അതിനാൽ അവയാണ് അഭികാമ്യം. SNP-കൾ സ്ഥിരീകരിക്കുന്നതിന് മാപ്പിംഗ് ടു സീക്വൻസ് എന്ന തന്ത്രം ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ മൈകോബാക്ടീരിയൽ ബയോഇൻഫോർമാറ്റിക്സ് വർക്ക്ഫ്ലോ ട്യൂബർകുലോസിസ് കോംപ്ലക്സിലെ അംഗങ്ങളെ നീക്കം ചെയ്തു. അതിനാൽ, വിശകലനത്തിൽ നിന്ന് ഞങ്ങൾ PE/PPE ജീനുകളും ഇൻഡലുകളും ഫിൽട്ടർ ചെയ്തു.
ബോവിലിസ്റ്റ് (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) പ്രകാരം, എല്ലാ SNP-കളെയും പ്രവർത്തനപരമായ വിഭാഗങ്ങളായി തിരിച്ചിരിക്കുന്നു. SnpEff പൈപ്പ്‌ലൈൻ (https://pcingola.github.io/SnpEff/) ഉപയോഗിച്ച് SNP അനന്തരഫലങ്ങൾ (പര്യായപരമായതോ അല്ലാത്തതോ ആയ മാറ്റങ്ങൾ) അനുമാനിക്കുന്നു. മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസ് AF2122/97 ജീനോമിന്റെ (LT708304.1) ഒരു പുതിയ ഡാറ്റാബേസ് സൃഷ്ടിച്ചു.
കോർ ജീനോം മൾട്ടിപ്പിൾ അലൈൻമെന്റ്, നിലവിൽ https://github.com/marbl/parsnp57 ൽ ലഭ്യമായ Parsnp v1.2 ഉപയോഗിച്ചാണ് നടത്തിയത്, 69 പൂർണ്ണ ജീനോമുകൾ/ഡ്രാഫ്റ്റ് അസംബ്ലികൾ (ഓപ്ഷൻ -c ഉപയോഗിച്ച്) ഉപയോഗിച്ചു, M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) ഒരു റഫറൻസായി ഉപയോഗിച്ചു. നാല് കോർ മൾട്ടിപ്പിൾ അലൈൻമെന്റുകൾ നടത്തി: Eu2 ക്ലോണിംഗ് കോംപ്ലക്സിലെ അംഗങ്ങൾ മാത്രം (n = 37), യൂറോപ്യൻ ക്ലോണിംഗ് കോംപ്ലക്സിലെ എല്ലാ അംഗങ്ങളും ഉൾപ്പെടെ (n = 44), യൂറോപ്യൻ, ആഫ്രിക്കൻ ക്ലോണിംഗ് കോംപ്ലക്സുകളുടെ ജംഗ്ഷൻ പോയിന്റ് ഉൾപ്പെടെ (n = 51), ഈ പഠനത്തിൽ എല്ലാ മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസും ഉൾപ്പെടുന്നു (n = 70).
RAxML ഉപയോഗിച്ച് CIPRES സയൻസ് ഗേറ്റ്‌വേ v3.3 (http://www.phylo.org/)58 ഉപയോഗിച്ച് പരമാവധി സാധ്യത (ML) ഫൈലോജെനെറ്റിക് ട്രീ അനുമാനിക്കുന്നതിനും 1000 ഗൈഡഡ് റെപ്ലിക്കേഷനുകൾ നടത്തുന്നതിനും Parsnp സൃഷ്ടിച്ച കോർ അലൈൻമെന്റ് ഉപയോഗിക്കുന്നു.
പുനഃസംയോജന പരിപാടികളുടെ സാന്നിധ്യം സമാന്തരമായി പരിശോധിക്കുന്നതിന് മൂന്ന് വ്യത്യസ്ത അൽഗോരിതങ്ങളും ബയോഇൻഫോർമാറ്റിക്സ് ഉപകരണങ്ങളും ഉപയോഗിക്കുന്നു: സ്പ്ലിറ്റ്സ്ട്രീ4 സോഫ്റ്റ്‌വെയർ, ഗബ്ബിൻസ് (ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് സീക്വൻസുകളിൽ പുനഃസംയോജനത്തിലൂടെ നിഷ്പക്ഷമായ വംശാവലി) പൈപ്പ്‌ലൈൻ, ആർഡിപി4 (റീകോമ്പിനേഷൻ ഡിറ്റക്ഷൻ പ്രോഗ്രാം, പതിപ്പ് ബീറ്റ 4.101) സോഫ്റ്റ്‌വെയർ.
SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59-ൽ നടപ്പിലാക്കിയ സ്പ്ലിറ്റ് ഡീകോമ്പോസിഷൻ രീതി, സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ വെരിഫിക്കേഷനായി Phi ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച്, റൂട്ട്‌ലെസ് ഫൈലോജെനെറ്റിക് നെറ്റ്‌വർക്ക് കണക്കാക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു, കൂടാതെ സിഗ്നിഫിക്കൻസ് ത്രെഷോൾഡ് p = 0.05 ആണ്. Parsnp-യുടെ കോർ മൾട്ടി-അലൈൻമെന്റ് വിശകലനം ഇൻപുട്ടായി ഉപയോഗിക്കുന്നു, കൂടാതെ ഒരു നെറ്റ്‌വർക്ക് സ്റ്റാൻഡേർഡ് എന്ന നിലയിൽ സ്പ്ലിറ്റിംഗ് ഡീകോമ്പോസിഷൻ സാക്ഷാത്കരിക്കപ്പെടുന്നു.
മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസിൽ റീകോമ്പിനേഷന്റെ സ്വാധീനം വിലയിരുത്തുന്നതിനുള്ള മറ്റൊരു മാർഗമായി ഗബ്ബിൻസിന്റെ പൈപ്പ്‌ലൈൻ v2.3.1 (https://github.com/sanger-patogens/gubbins60 ഡിഫോൾട്ട് പാരാമീറ്ററുകൾ ഉപയോഗിച്ചാണ് പ്രവർത്തിക്കുന്നത്. പൈപ്പ്‌ലൈനിൽ നടപ്പിലാക്കിയ അൽഗോരിതം പ്രസക്തമായ ക്ലോൺ ലൈനേജിനെ പുനർനിർമ്മിക്കുന്നു. ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റാ സെറ്റിന്റെയും റഫറൻസ് ജീനോമിന്റെയും (ബോവിൻ ബോവിഡ് AF2122/97, LT708304.1) പൂർണ്ണമായ ജീനോം/ഡ്രാഫ്റ്റ് അസംബ്ലി പരസ്പരബന്ധിതമാണ്; റീകോമ്പിനേഷൻ ഇവന്റിനെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന SNP ക്ലസ്റ്റർ കണ്ടെത്തുന്നതിന് ട്രീയുടെ ഓരോ ശാഖയിലും SNP യുടെ സ്ഥാനം സ്കാൻ ചെയ്യുക. ബ്രാഞ്ചിന്റെ പൂജ്യം റീകോമ്പിനേഷൻ ഇവന്റ് ഇല്ലെന്ന് കരുതുക, അതായത് ബ്രാഞ്ചിൽ സംഭവിക്കുന്ന SNP-കൾ തുല്യമായി വിതരണം ചെയ്യപ്പെടണം. പാർസ്എൻപിയിൽ നിന്നുള്ള കോർ മൾട്ടിപ്പിൾ അലൈൻമെന്റും RAxML-ൽ നിന്നുള്ള ഏറ്റവും മികച്ച സ്കോർ ചെയ്ത ML ട്രീയും ഇൻപുട്ട് ഫയലുകളായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.
ഒടുവിൽ, ഗബ്ബിൻസിന്റെ പൈപ്പ്‌ലൈൻ നിർദ്ദേശിച്ച പുനഃസംഘടനാ പരിപാടി സ്ഥിരീകരിക്കുന്നതിനായി, RDP467-ൽ നടപ്പിലാക്കിയ ആറ് അൽഗോരിതങ്ങൾ (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65, SiScan66) സ്ഥിരസ്ഥിതി ക്രമീകരണങ്ങൾക്ക് കീഴിൽ Parsnp-യുടെ കോർ മൾട്ടിപ്പിൾ അലൈൻമെന്റിൽ പ്രയോഗിക്കുന്നു. ഓരോ പുനഃസംയോജന പരിപാടിയും പരിശോധിക്കുന്നതിന് RDP4-ൽ നടപ്പിലാക്കിയ കുറഞ്ഞത് മൂന്ന് അൽഗോരിതങ്ങളെങ്കിലും ഒരു പ്രധാന സിഗ്നൽ സ്ഥിരമായി പ്രദർശിപ്പിക്കണമെന്ന് ഞങ്ങൾ നിർണ്ണയിച്ചു.
500 bp വരെയുള്ള ഒരു വിൻഡോയിൽ കോർ മൾട്ടിപ്പിൾ അലൈൻമെന്റുകൾ പരിശോധിച്ചുകൊണ്ട് ഗബ്ബിൻസും RDP സോഫ്റ്റ്‌വെയറും റീകോമ്പിനേഷൻ സിഗ്നലുകൾക്കായി തിരയുന്നുവെന്നും, ഡി നോവോ അസംബ്ലി സമയത്ത് PE/PPE ജീനുകൾ ഉൾപ്പെടുത്തുന്നത് കണ്ടെത്തിയ റീകോമ്പിനേഷൻ സിഗ്നലുകളെ തടസ്സപ്പെടുത്തില്ലെന്ന് ഉറപ്പാക്കുന്നുവെന്നും കണക്കിലെടുത്ത്, കൂടുതൽ വിശകലനം ഹോമോലീനിയറിറ്റി ഉപയോഗിച്ച് നടത്തുന്നു. റീകോമ്പിനേഷൻ ഇവന്റ് തിരിച്ചറിയുന്ന ജീനിന്റെ പരിസരം പരിശോധിക്കുക. പൂർണ്ണ ജീനോം ഉപയോഗിച്ചുള്ള സിൻലീനിയർ മാപ്പ് MAUVE-മൾട്ടി-ജീനോം അലൈൻമെന്റ് (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) ഉപയോഗിച്ചാണ് നിർമ്മിച്ചത്, പ്രാദേശിക ജീനോം ട്രാൻസ്‌ലോക്കേഷനുകളോ ഇൻവേർഷനുകളോ ഒഴിവാക്കാൻ. കൂടാതെ, സിന്റ്‌ടാക്സ് വെബ് സെർവർ (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) വഴി അമിനോ ആസിഡ് ശ്രേണിയിൽ ഹോമോലീനിയാരിറ്റി വിശകലനം നടത്താൻ മുഴുവൻ ജീനോമും ഉപയോഗിച്ചു.
പോർച്ചുഗീസ് മൾട്ടി-ഹോസ്റ്റ് ട്യൂബർക്കുലോസിസ് സിസ്റ്റത്തിൽ നിന്ന് ലഭിച്ച ജീനോം ഡാറ്റ സെറ്റിന്റെ കൂടുതൽ ആഴത്തിലുള്ള വിശകലനം, സാഹിത്യത്തിൽ പരാമർശിച്ചിരിക്കുന്ന ജീനുകളുടെ പോളിമോർഫിസം പരിശോധിക്കുക എന്നതാണ്. ഈ ജീനുകൾ 37,38 ഉം HGT (DNA റിപ്പയർ, റെപ്ലിക്കേഷൻ, റീകോമ്പിനേഷൻ) സിസ്റ്റം ഘടകങ്ങൾ 39 വഴി MTBC പൂർവ്വികർ നേടിയ ജീൻ എൻകോഡിംഗ് 3R ഉം ആണ്. ജീൻ വൈവിധ്യവും ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് വൈവിധ്യവും (π) കണക്കാക്കാൻ ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) ഉപയോഗിക്കുക, DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) ഉപയോഗിക്കുക, കൂടാതെ Tajima's D ന്യൂട്രൽ ടെസ്റ്റ് പാരാമീറ്റർ ഇൻപുട്ടും.
69 മൈകോപ്ലാസ്മ ബോവിസ് ഐസൊലേറ്റുകളും റഫറൻസ് ജീനോമുകളും അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള പരമാവധി സാധ്യത (ML) ഫൈലോജെനെറ്റിക് ട്രീ ലഭിച്ചു (ചിത്രം 2A). സിംഗിൾ-ജീൻ അധിഷ്ഠിത മരങ്ങളുമായോ മൾട്ടി-ലോക്കസ് അധിഷ്ഠിത മരങ്ങളുമായോ താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, ഈ തന്ത്രം കൂടുതൽ ശക്തമായ മരങ്ങൾ സൃഷ്ടിക്കാൻ അനുവദിക്കുന്നു, അവ മുഴുവൻ ജീനോമിന്റെയും വ്യതിയാനം പിടിച്ചെടുക്കുന്നില്ല, അതിനാൽ സ്പീഷീസുകൾ 68,69 തമ്മിൽ വിവേചനം കാണിക്കാനുള്ള കഴിവ് കുറവാണ്. ML മരത്തിന്റെ ടോപ്പോളജിക്കൽ ഘടന സാധാരണയായി ക്ലോണുകളുടെ സങ്കീർണ്ണമായ വർഗ്ഗീകരണവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. Eu2 ന്റെ ജീനോം ഒരു ശാഖയിൽ ക്ലസ്റ്റർ ചെയ്തിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ Af1 ന്റെ ജീനോമും ഒരുമിച്ച് ക്ലസ്റ്റർ ചെയ്തിരിക്കുന്നു (ചിത്രം 2A). മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസിന്റെ അറിയപ്പെടുന്ന പരിണാമ ബന്ധവുമായും ഫലം പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, അതായത്, Eu1 അംഗവും മറ്റ് എല്ലാ ക്ലോണൽ കോംപ്ലക്സുകളും ജീനോമുകളും അടങ്ങുന്ന ഗ്രൂപ്പും തമ്മിൽ വലിയ വ്യത്യാസമുണ്ട്, പക്ഷേ ക്ലോണൽ കോംപ്ലക്സ് 30 വ്യക്തമാക്കിയിട്ടില്ല. ക്ലോണൽ കോംപ്ലക്‌സും ഫൈലോജെനെറ്റിക് ട്രീയിൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ട ബന്ധവും തമ്മിലുള്ള ചെറിയ പൊരുത്തക്കേട്, ക്ലോണൽ കോംപ്ലക്‌സിനെ പ്രത്യേക ജീനോമിക് മേഖലകളെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയാണ് വിവരിച്ചിരിക്കുന്നത് എന്ന വസ്തുതയിലൂടെ വിശദീകരിക്കാം, അതേസമയം ഫൈലോജെനെറ്റിക് ട്രീ മുഴുവൻ ജീനോമിനെയും പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന കോർ ജീനോമുകളുടെ ഒന്നിലധികം വിന്യാസങ്ങളെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്.
റീകോമ്പിനേഷൻ സൈറ്റ് നീക്കം ചെയ്യുന്നതിന് മുമ്പും ശേഷവുമുള്ള (എ) യും ശേഷവുമുള്ള മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസ് ജീനോമിന്റെ കോർ ജീനോം വിന്യാസത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയാണ് പരമാവധി സാധ്യത ഫൈലോജെനെറ്റിക് ട്രീ (ജിടിആർ) നിർമ്മിച്ചിരിക്കുന്നത്. ശാഖകളുടെ നിറങ്ങൾ മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസ് ക്ലോൺ സമുച്ചയത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു: യൂറോപ്പ് 1 പർപ്പിൾ, യൂറോപ്പ് 2 ചുവപ്പ്, യൂറോപ്പ് 3 നീല, ആഫ്രിക്ക 1 ഓറഞ്ച്, ആഫ്രിക്ക 2 പച്ച. മരം വേരൂന്നിയതും സ്കെയിലിലേക്ക് വലിച്ചെടുക്കുന്നതുമാണ്, കൂടാതെ ഓരോ സൈറ്റിനും പകരമായി ശാഖയുടെ നീളം അളക്കുന്നു.
മൈകോബാക്ടീരിയം ട്യൂബർക്കുലോസിസ് കോംപ്ലക്സിനെ ക്ലോണലി പരിണമിച്ചതായി വിവരിക്കുന്നു, കൂടാതെ വർഷങ്ങളായി ശേഖരിച്ച മിക്ക തെളിവുകളും നിലവിലുള്ള HGT, പുനഃസംയോജന സംഭവങ്ങൾ MTBC15,17,18 ന്റെ കണ്ടെത്താവുന്ന തലത്തിൽ സംഭവിക്കില്ല എന്ന ആശയത്തെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു.
മുൻകാല പ്രവർത്തനങ്ങൾ MTBC സ്ട്രെയിനുകൾക്കിടയിൽ പരിമിതമായ പുനഃസംയോജനം ഉണ്ടാകാമെന്ന് കാണിക്കുന്നു20,21, അതേസമയം മറ്റുള്ളവർ അളക്കാവുന്ന പുനഃസംയോജന സംഭവങ്ങൾ തിരിച്ചറിയുന്നതിൽ പരാജയപ്പെട്ടു70,71. മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസിൽ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ച് ഈ പ്രശ്നം വീണ്ടും ചർച്ച ചെയ്യുക, ഇത് മൈകോബാക്ടീരിയം ട്യൂബർകുലോസിസ് 70,71 മാത്രം പരിഗണിച്ച മുൻ കൃതിയിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമാണ്; അല്ലെങ്കിൽ MTBC മൊത്തത്തിൽ പരിഗണിക്കുക, 20 പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന M. ബോവിസുകളൊന്നുമില്ല; അല്ലെങ്കിൽ നിയന്ത്രിത കന്നുകാലി ഭിന്നസംഖ്യകൾ മാത്രം പരിഗണിക്കുക. മൈകോബാക്ടീരിയ ഡാറ്റാസെറ്റിൽ, ഈ കൃതിയിൽ, പുനഃസംയോജനത്തിനായി സ്‌ക്രീൻ ചെയ്യാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന എല്ലാ ക്ലോണൽ കോംപ്ലക്‌സുകളെയും പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന ആകെ 70 സ്‌ട്രെയിനുകൾ ഉണ്ട്. ഡാറ്റാ സെറ്റ് നാല് ക്യുമുലേറ്റീവ് ലെവലുകൾ അനുസരിച്ച് സ്കെയിൽ ചെയ്തിരിക്കുന്നു: (1) Eu2 അംഗങ്ങൾ, (2) എല്ലാ യൂറോപ്യൻ ക്ലോൺ കോംപ്ലക്‌സ് അംഗങ്ങളും (അതായത് യൂറോപ്പ്), (3) യൂറോപ്യൻ, ആഫ്രിക്കൻ ക്ലോൺ കോംപ്ലക്‌സ് (Eu + Af) കൂടാതെ (4) മുഴുവൻ ഡാറ്റ ശേഖരണങ്ങളും (ഇതിനകം വിവരിച്ചിരിക്കുന്ന ഏതെങ്കിലും ക്ലോണിംഗ് കോംപ്ലക്‌സുകളിൽ ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടില്ലാത്ത ജീനോമുകൾ ഉൾപ്പെടെ).
ഈ സിദ്ധാന്തത്തെ കൂടുതൽ പഠിക്കുന്നതിനായി, ജീനോമുകൾക്കിടയിൽ പുനഃസംയോജന സംഭവങ്ങളുടെ അഭാവം വിലയിരുത്തുന്നതിനായി ഒരു സ്പ്ലിറ്റ്-ഡീകോമ്പോസിഷൻ നെറ്റ്‌വർക്ക് നടത്തി, കാരണം ഈ രീതിക്ക് വ്യക്തികൾ തമ്മിലുള്ള പൂർവ്വിക ബന്ധം ദൃശ്യവൽക്കരിക്കാനും വൈരുദ്ധ്യമുള്ള ഫൈലോജെനെറ്റിക് സിഗ്നലുകൾ പ്രദർശിപ്പിക്കാനും കഴിയും. വിശകലനത്തിലെ നാല് ഡാറ്റാ സെറ്റുകളും നെറ്റ്‌വർക്കിൽ ലൂപ്പുകളുടെ നിലനിൽപ്പ് സ്ഥിരീകരിച്ചു (അതായത്, ഒറ്റ വൃക്ഷമായി ഒത്തുചേരാത്ത പ്രദേശങ്ങൾ), എന്നാൽ ഫൈ പരിശോധനയ്ക്ക് സ്ഥിതിവിവരക്കണക്ക് പിന്തുണയില്ല (Eu2, p = 0.0956; യൂറോപ്പ്, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; മുഴുവൻ ഡാറ്റാ സെറ്റ് p = 0.2451), ഇത് പുനഃസംഘടന സംഭവങ്ങളുടെ നിലനിൽപ്പിന് മോശം തെളിവുകൾ നൽകുന്നു (ചിത്രം 3A-D).
യൂറോപ്പിൽ 2 ജീനോമുകൾ (n = 37) (A), യൂറോപ്യൻ ജീനോമുകൾ (n = 44) (B), യൂറോപ്യൻ, ആഫ്രിക്കൻ ജീനോമുകൾ (n = 51) (C) കൂടാതെ മുഴുവൻ ഡാറ്റാ സെറ്റും (n = 70) (D) ഉണ്ട്.
ഈ വിശകലനത്തിനുശേഷം, എല്ലാ നെറ്റ്‌വർക്കുകളിലെയും ചാക്രിക നിരീക്ഷണങ്ങൾ കണക്കിലെടുത്ത്, ക്ലോണൽ ലൈനേജ് പുനർനിർമ്മിക്കുന്നതിനും എം. ബോവിസ് ജീനോമിൽ പുനഃസംയോജനത്തിന്റെ ഫലത്തിന്റെ അനുമാനത്തിന് അനുബന്ധമായി ഗബ്ബിൻ പൈപ്പ്‌ലൈനിൽ നടപ്പിലാക്കിയ പുനർനിർമ്മാണ അൽഗോരിതം പ്രയോഗിച്ചു. പുനഃസംയോജന സംഭവങ്ങളുടെ സഞ്ചിത എണ്ണം അനുമാനിക്കുക, അവയിൽ ഭൂരിഭാഗവും ടെർമിനൽ ശാഖകളിലാണ് (അതായത്, ഒരൊറ്റ ജീനോമിൽ) സംഭവിച്ചത് (പട്ടിക 2). ഈ സൂചകങ്ങൾ മുഴുവൻ ഡാറ്റാ സെറ്റിന്റെയും സ്ഥിരത കാണിക്കുന്നു, പുനഃസംയോജന സംഭവങ്ങളുടെ ആവൃത്തി മ്യൂട്ടേഷനുകളുടെ 200 മുതൽ 300 മടങ്ങ് വരെയാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ശാഖയിലെ പുനഃസംയോജനത്തിന്റെയും പോയിന്റ് മ്യൂട്ടേഷനുകളുടെയും ആപേക്ഷിക നിരക്കുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന rho/theta പാരാമീറ്റർ 0.0037 നും 0.0056 നും ഇടയിലാണെന്ന് തോന്നുന്നു (പട്ടിക 3). അടുത്തിടെ, 38 M. bovis സ്ട്രെയിനിന്റെ പ്രസിദ്ധീകരിച്ച കൃതി ഈ ഡാറ്റാസെറ്റിൽ ലഭിച്ചതിനേക്കാൾ ഉയർന്ന rho/theta മൂല്യം (rho/theta = 0.1) പ്രകടമാക്കി, എന്നാൽ പാറ്റാനെയും സഹപ്രവർത്തകരും പുനഃസംയോജന പാരാമീറ്ററുകൾ അനുമാനിക്കാൻ റഫറൻസ് അധിഷ്ഠിത അസംബ്ലി ഉപയോഗിച്ചു, അസംബ്ലി നടപടിക്രമം കാരണം ഒരു നടപടിക്രമ വിശദാംശം, ടെർമിനൽ ബ്രാഞ്ചിലെ അനുമാനാത്മക പുനഃസംയോജന സംഭവങ്ങളുടെ സമൃദ്ധിയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.
അടുത്തതായി, r/m പാരാമീറ്റർ പുനഃസംയോജനത്തിന്റെയും മ്യൂട്ടേഷൻ ആമുഖത്തിന്റെയും വൈവിധ്യ അനുപാതത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, അതിന്റെ ശരാശരി മൂല്യം 0.025 നും 0.037 നും ഇടയിലാണ്, ഇത് മ്യൂട്ടേഷനുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, പുനഃസംയോജനം M. bovis ന്റെ ജനിതക വൈവിധ്യത്തിൽ മൊത്തത്തിലുള്ള സ്വാധീനം കുറവാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (പട്ടിക 3)). വിപുലമായ താരതമ്യത്തിനായി, 23 ജീനോമുകൾ അടങ്ങിയ MTBC ഡാറ്റാസെറ്റിനായി r/m പാരാമീറ്റർ കണക്കാക്കാൻ സമാനമായ ഒരു രീതി ഉപയോഗിച്ചു, ഇത് ശരാശരി മൂല്യം 0.48620 കാണിക്കുന്നു, അതേസമയം Patané യുടെയും സഹപ്രവർത്തകരുടെയും 38 M. bovis ഡാറ്റാസെറ്റിന്, ഇത് ശരാശരി മൂല്യം 0.98 ആണെന്ന് തെളിയിച്ചു. ആദ്യ പഠനത്തിൽ, M. bovis (M. bovis BCG ഉം റഫറൻസ് സ്ട്രെയിനും) ന്റെ പ്രവർത്തനത്തിൽ ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുള്ള 23 ജീനോമുകളിൽ രണ്ടെണ്ണം മാത്രമേ ഉള്ളൂ, അതിനാൽ ലഭിച്ച മൂല്യം M. tuberculosis ജീനോമിന്റെ അമിതപ്രയോഗം കാരണം പക്ഷപാതപരമായിരിക്കാം. രണ്ടാമത്തെ റിപ്പോർട്ടിൽ, വിശകലനം ചെയ്ത മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസ് ജനസംഖ്യ പ്രധാനമായും യുണൈറ്റഡ് സ്റ്റേറ്റ്സിൽ നിന്നും കന്നുകാലി ഹോസ്റ്റുകളിൽ നിന്നും വീണ്ടെടുത്തു. ഇതിനു വിപരീതമായി, ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റാ സെറ്റിൽ, കൂടുതൽ ഭൂമിശാസ്ത്രപരമായ സ്ഥാനങ്ങളും ഹോസ്റ്റ് സ്പീഷീസുകളും പ്രതിനിധീകരിക്കപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ വ്യത്യസ്ത ജനസംഖ്യാ ജനിതക സവിശേഷതകളുള്ള വ്യത്യസ്ത ക്ലോണൽ കോംപ്ലക്സുകളായി ഗ്രൂപ്പുചെയ്‌തിരിക്കുന്ന ജീനോമുകളും ഉപയോഗിക്കുന്നു, അങ്ങനെ കൂടുതൽ ആഴമേറിയതും വിശാലവുമായ ജനസംഖ്യാ പരിജ്ഞാനം കൈവരിക്കുന്നു. ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റാ സെറ്റുമായി ലഭിച്ച വ്യത്യാസം r/m ശരാശരി മൂല്യം, ഒരേ ടാക്സോണമിക് സ്പീഷീസുകൾക്ക് നൽകിയിരിക്കുന്ന വംശങ്ങൾക്കിടയിൽ പുനഃസംയോജനത്തിന്റെ അളവ് വളരെയധികം വ്യത്യാസപ്പെടുന്നു എന്ന ആശയവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, അതിനാൽ ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് എം. ബോവിസ് ക്ലോൺ കോംപ്ലക്സ് പുനഃസംയോജന വ്യത്യാസങ്ങൾ പ്രകടിപ്പിച്ചേക്കാം എന്നാണ്. ഡിഡെലോട്ട് & മെയ്ഡൻ72 നിർദ്ദേശിച്ചതുപോലെയാണ് ആഘാതം. എന്നിരുന്നാലും, കൂടുതൽ എം. ബോവിസ് ജീനോമുകൾ ഉൾപ്പെടുത്തി ഈ ഡാറ്റ സെറ്റ് ഗണ്യമായി വികസിപ്പിക്കുന്നത് ഈ പോയിന്റിന്റെ കൂടുതൽ വ്യക്തതയ്ക്ക് അനുവദിക്കും. r/m, rho/theta പാരാമീറ്ററുകൾ ശാഖകൾക്കിടയിലുള്ള വ്യതിയാനം കാണിക്കുന്നു, കൂടാതെ ഈ ഫലം മറ്റ് ബാക്ടീരിയൽ സ്പീഷീസുകളെക്കുറിച്ചുള്ള റിപ്പോർട്ടുകളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു72,73.
ഒടുവിൽ, ഗബ്ബിൻസിന്റെ പൈപ്പ്‌ലൈൻ തിരിച്ചറിഞ്ഞ പുനഃസംഘടനാ ഇവന്റുകൾ സ്ഥിരീകരിക്കുന്നതിനായി, വ്യത്യസ്ത കോർ മൾട്ടി-താരതമ്യങ്ങൾ സ്വതന്ത്രമായി പരീക്ഷിക്കുന്നതിനായി RDP4 സോഫ്റ്റ്‌വെയറിൽ ആറ് വ്യത്യസ്ത അൽഗോരിതങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു. ആഗോളതലത്തിൽ, ഗബ്ബിൻസിന്റെ തിരിച്ചറിഞ്ഞ ഇവന്റുകളിൽ പകുതിയിൽ താഴെ മാത്രമേ RDP4 സ്ഥിരീകരിച്ചിട്ടുള്ളൂ (പട്ടികകൾ 4 ഉം 5 ഉം). മുഴുവൻ ഡാറ്റാ സെറ്റും കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, മൂന്ന് പുനഃസംയോജന ഇവന്റുകൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു, രണ്ടെണ്ണം ആന്തരിക നോഡുകൾ ഉൾപ്പെടുന്നതും മറ്റൊന്ന് ഒരു ടെർമിനൽ ശാഖയിലെ ഒരൊറ്റ ജീനോം ഉൾപ്പെടുന്നതുമാണ്, ഇതിനായി ക്ലോണൽ കോംപ്ലക്സുകൾ നൽകാൻ കഴിഞ്ഞില്ല (പട്ടികകൾ 4 ഉം 5 ഉം). ടെർമിനൽ ശാഖകളിലെ ഇവന്റുകളുടെ തിരിച്ചറിയൽ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് സമകാലിക M. bovis സ്ട്രെയിനുകളിൽ പുനഃസംയോജനം ഇപ്പോഴും പുരോഗമിക്കുകയാണെന്നോ ഫലം തെറ്റായിപ്പോയെന്നോ ആകാം70. ഈ സാങ്കൽപ്പിക പുനഃസംയോജന മേഖലയിൽ, ഏകദേശം 20% സ്ഥാനങ്ങളിലും നിർവചിക്കപ്പെടാത്ത ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ (N) ഉണ്ട്, അങ്ങനെ പുനഃസംയോജന സിഗ്നലിനെ ബാധിക്കുന്നു (അനുബന്ധ ചിത്രം 2). കൂടാതെ, ഈ പ്രദേശം rrs ജീനിനെ ബാധിക്കുന്നു, ഇത് വളരെ സംരക്ഷിക്കപ്പെടുമെന്ന് പ്രതീക്ഷിക്കുന്ന 16S റൈബോസോമൽ RNA എൻകോഡ് ചെയ്യുന്നു, അതിനാൽ ഈ അനുമാന പുനഃസംയോജന സിഗ്നൽ സീക്വൻസിംഗ് പിശകുകളുടെയോ തെറ്റായ ക്രമീകരണത്തിന്റെയോ ഫലമായിരിക്കാം. തുടർന്ന് Mb0003 നും മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസ് AF2122/97 നും ഇടയിലുള്ള മുഴുവൻ ജീനോം വിന്യാസവും നടത്തി, നിർവചിക്കപ്പെടാത്ത ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളുടെയും SNP-കളുടെയും നിലനിൽപ്പ് സ്ഥിരീകരിച്ചു, അതിനാൽ തെറ്റായ വിന്യാസവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട സാധ്യമായ പ്രശ്നങ്ങൾ ഈ കൃതിയിൽ നടപ്പിലാക്കിയ ജൈവ വിവരങ്ങൾ മൂലമല്ല പ്രോഗ്രാം പഠിച്ചതിനുശേഷം പ്രത്യക്ഷപ്പെട്ടു.
ആന്തരിക നോഡുകളുടെ പുനഃസംയോജന മേഖലകളിൽ വിടവുകളോ നിർവചിക്കപ്പെടാത്ത ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളോ കണ്ടെത്തിയില്ല (ചിത്രങ്ങൾ 4 ഉം 5 ഉം). ഈ സംഭവങ്ങളെ സംബന്ധിച്ച്, ഒന്നിൽ Eu2 ജീനോം മാത്രമേ അടങ്ങിയിട്ടുള്ളൂ, കൂടാതെ pks12 ജീനിനെ ബാധിക്കുന്നു, ഇത് സാധ്യമായ പോളികെറ്റൈഡ് സിന്തേസിനെ എൻകോഡ് ചെയ്യുന്നു; മറ്റൊന്ന് Eu1 ജീനോമിൽ രജിസ്റ്റർ ചെയ്തിട്ടുണ്ട്, കൂടാതെ സാധ്യമായ നൈട്രേറ്റ് റിഡക്റ്റേസിനെ എൻകോഡ് ചെയ്യുന്ന narX ജീനിനെ ബാധിക്കുന്നു (പട്ടിക 4). പൊതുവേ, സ്ഥിതിവിവരക്കണക്ക് പിന്തുണയോടെ പരിമിതമായ എണ്ണം പുനഃസംയോജന ശകലങ്ങൾ ഉണ്ടെന്ന് റീകോമ്പിനേഷൻ വിശകലനം കാണിക്കുന്നു, കൂടാതെ അനുമാനിച്ച സൂചകങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് പുനഃസംയോജനത്തിന് M. bovis വംശത്തിൽ കുറഞ്ഞ സ്വാധീനമുണ്ടെന്ന്. പുനഃസംയോജന സിഗ്നൽ കുറവായിരിക്കുമെന്ന് പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു, പക്ഷേ പശ്ചാത്തല ശബ്ദത്തിൽ നിന്ന് യഥാർത്ഥ പരിണാമ സിഗ്നലിനെ വേർതിരിച്ചറിയേണ്ടത് പ്രധാനമാണ്, ഇത് ഒരു വെല്ലുവിളി നിറഞ്ഞ ജോലിയാണ്. റഫറൻസ് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള അസംബ്ലിയും പൊരുത്തക്കേട് പ്രശ്നങ്ങളും 70, 71 വഴി അവതരിപ്പിച്ച ശബ്ദ സിഗ്നൽ കുറയ്ക്കുന്നതിന്, പൂർണ്ണമായ ജീനോം ഒഴികെ ബാക്കിയുള്ളവയെല്ലാം ആദ്യം മുതൽ കൂട്ടിച്ചേർക്കുകയും അസംബ്ലി ഗുണനിലവാരം QUAST പൈപ്പ്‌ലൈൻ വിശകലനം (സപ്ലിമെന്ററി പട്ടിക 1) വഴി പരിശോധിക്കുകയും ഉറപ്പാക്കുകയും ചെയ്തു. കൂടാതെ, മൊത്തത്തിലുള്ള സർവേയുടെ ദൃഢതയും കൃത്യതയും നൽകുന്നതിനായി അനുബന്ധ വിശകലനങ്ങളുടെ ഒരു പരമ്പര നടത്തി. അതിനാൽ, മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസ് AF2122/97 നെതിരെ റീഡ് മാപ്പിംഗ് വഴി narX, pks12 ജീനുകളുടെ സീക്വൻസിംഗ് ഗുണനിലവാരം വിലയിരുത്തി. രീതി വിഭാഗത്തിൽ പരാമർശിച്ചിരിക്കുന്ന മാനദണ്ഡങ്ങൾ (കുറഞ്ഞത് 20 റീഡിംഗുകളും 0.9 മാറ്റ ആവൃത്തിയും) പ്രയോഗിച്ചുകൊണ്ട് റീകോമ്പിനേഷൻ മേഖലയിലെ ശുപാർശ ചെയ്യുന്ന SNP സ്ഥാനം സ്ഥിരീകരിച്ചു. രണ്ട് ജീനോമുകളിലും (Mb1792361, Mb7240415; 2.3%) pks12 ജീനോമിന്റെ ജീനോമുകളിലും (Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756, Mb12 ജീനുകളിലും) narX ജീനിന്റെ പോളിമോർഫിസം പൂർണ്ണമായും സ്ഥിരീകരിച്ചു. എന്നിരുന്നാലും, Mb2043 എന്ന ജീനോമിന്, എട്ട് സ്ഥാനങ്ങളിൽ ആറെണ്ണം റീഡ് ഡെപ്ത് മാനദണ്ഡം പാലിക്കുന്നില്ല, കാരണം SNP പരമാവധി 17 റീഡുകൾ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു, ഇത് സ്ഥാപിത കട്ട്ഓഫ് മൂല്യമായ 20 ന് താഴെയാണ്. അതിനാൽ, ഈ ജീനോം സൈറ്റിൽ ആറ് ജീനോമുകളുടെ (8.6%) പുനഃസംയോജനം സ്ഥിരീകരിക്കാൻ കഴിയും (ചിത്രങ്ങൾ 4 ഉം 5 ഉം).
മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസ് ഡാറ്റാസെറ്റിന്റെ റീകോമ്പിനേഷൻ മേഖലാ വിന്യാസത്തിന്റെ വിശദമായ ദൃശ്യവൽക്കരണം, സാധ്യമായ നൈട്രേറ്റ് റിഡക്റ്റേസ് എൻകോഡ് ചെയ്യുന്ന നാർഎക്സ് ജീനിനെ ബാധിക്കുന്നു. ആന്തരിക നോഡുകളുടെ റീകോമ്പിനേഷൻ മേഖലയിൽ വിടവുകളോ നിർവചിക്കപ്പെടാത്ത ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളോ കണ്ടെത്തിയില്ല. ഈ പ്രത്യേക സംഭവം Eu1 ജീനോമിൽ രജിസ്റ്റർ ചെയ്തിട്ടുണ്ട്. മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസ് AF2122/97 ന്റെ റീഡുകൾ പ്ലോട്ട് ചെയ്തുകൊണ്ട് നാർഎക്സ് ജീനിന്റെ സീക്വൻസിംഗ് ഗുണനിലവാരം വിലയിരുത്തി. രീതി വിഭാഗത്തിൽ പരാമർശിച്ചിരിക്കുന്ന മാനദണ്ഡങ്ങൾ (കുറഞ്ഞത് 20 റീഡിംഗുകളും 0.9 മാറ്റ ആവൃത്തിയും) പ്രയോഗിച്ചുകൊണ്ട് റീകോമ്പിനേഷൻ ഏരിയയിലെ ശുപാർശ ചെയ്യുന്ന SNP സ്ഥാനം സ്ഥിരീകരിക്കുക. Mb1792361, Mb7240415 (2.3%) എന്നിവയുടെ ജീനോമുകളിൽ നാർഎക്സ് ജീനിന്റെ പോളിമോർഫിസം പൂർണ്ണമായും സ്ഥിരീകരിച്ചു.
pks12 ജീനിനെ ബാധിക്കുന്ന മൈകോപ്ലാസ്മ ബോവിസ് ഡാറ്റാസെറ്റിന്റെ റീകോമ്പിനേഷൻ മേഖല വിന്യാസത്തിന്റെ വിശദമായ ദൃശ്യവൽക്കരണം. ആന്തരിക നോഡുകളുടെ റീകോമ്പിനേഷൻ മേഖലയിൽ വിടവുകളോ നിർവചിക്കപ്പെടാത്ത ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളോ കണ്ടെത്തിയില്ല. സാധ്യമായ പോളികെറ്റൈഡ് സിന്തേസിനെ എൻകോഡ് ചെയ്യുന്ന pks12 ജീനിനെ ബാധിക്കുന്ന സംഭവത്തെക്കുറിച്ച്, അതിൽ Eu2 ജീനോം മാത്രമേ അടങ്ങിയിട്ടുള്ളൂ. മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസ് AF2122/97 ന്റെ റീഡ് മാപ്പിംഗ് വഴി pks12 ന്റെ സീക്വൻസിംഗ് ഗുണനിലവാരം വിലയിരുത്തി. രീതി വിഭാഗത്തിൽ പരാമർശിച്ചിരിക്കുന്ന മാനദണ്ഡങ്ങൾ (കുറഞ്ഞത് 20 റീഡിംഗുകളും 0.9 മാറ്റ ആവൃത്തിയും) പ്രയോഗിച്ചുകൊണ്ട് റീകോമ്പിനേഷൻ ഏരിയയിലെ ശുപാർശിത SNP സ്ഥാനം സ്ഥിരീകരിക്കുക. Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043, Mb1960 എന്നീ ജീനോമുകളുടെ പോളിമോർഫിസങ്ങൾ പൂർണ്ണമായും സ്ഥിരീകരിച്ചു.
PE, PPE ജീനുകൾക്ക് ഇല്ലുമിന സീക്വൻസിംഗും മിസ്‌മാപ്പിംഗും വഴി എളുപ്പത്തിൽ തെറ്റായി വായിക്കാൻ കഴിയുന്ന ആവർത്തന മേഖലകളുണ്ട്, അതിനാൽ മാപ്പിംഗ്-ടു-സീക്വൻസ് തന്ത്രം ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ മാത്രമേ M. ട്യൂബർക്കുലോസിസ് അംഗങ്ങളുടെ ബയോഇൻഫോർമാറ്റിക്സ് വർക്ക്ഫ്ലോയിൽ നിന്ന് അവ സാധാരണയായി ഇല്ലാതാക്കപ്പെടുകയുള്ളൂ. ഈ കൃതിയിൽ പ്രയോഗിച്ചിരിക്കുന്ന റീകോമ്പിനേഷൻ ഇവന്റുകളുടെ അനുമാനം PE/PPE ഫിൽട്ടർ ചെയ്യാതെ ഡി നോവോ അസംബ്ലിയെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്. സ്പ്ലിറ്റ്സ്ട്രീ, ഗബ്ബിൻ പൈപ്പ്ലൈൻ, RDP4 സോഫ്റ്റ്‌വെയർ എന്നിവയിലൂടെ മൂന്ന് വ്യത്യസ്ത പൂരക രീതികളും അൽഗോരിതങ്ങളും നടപ്പിലാക്കുന്നതിലൂടെ, പിശക് സിഗ്നലുകൾ മൂലമുണ്ടാകുന്ന പുനഃസംഘടിപ്പിച്ച പ്രദേശങ്ങൾ പ്രോസസ്സ് ചെയ്യുന്നതിനും ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുന്നതിനും പ്രയോഗിച്ച തന്ത്രങ്ങൾ ശക്തമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ വിശ്വസിക്കുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, SNP ക്ലസ്റ്ററുകളെ തിരിച്ചറിയുന്നതിനായി ഗബ്ബിൻസിലെയും RDP4 സോഫ്റ്റ്‌വെയറിലെയും PE/PPE ജീനിന്റെ ഇടപെടൽ ഒഴിവാക്കുന്നതിനും അതിനാൽ narX, pks12 ജീനുകളെ ബാധിക്കാൻ നിർദ്ദേശിക്കപ്പെട്ട റീകോമ്പിനേഷൻ മേഖലകളുടെ തിരിച്ചറിയലിനും, ഈ ജീനുകളുടെ അയൽപക്കം പരിശോധിച്ചു (അനുബന്ധ ചിത്രം 3–5). M. bovis AF2122/97-ൽ, narX ജീനിനെ narK2, Mb1764c എന്നിവയാൽ വേർതിരിക്കുന്നു, അതേസമയം pks12 Mb2075c e Mb2073c കൊണ്ട് ചുറ്റപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (അനുബന്ധ ചിത്രം 3-5). പൂർണ്ണ ജീനോമിന്റെ MAUVE സിൻലൈൻ മാപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് സൃഷ്ടിച്ച മാപ്പ് ജീൻ സീക്വൻസ് കൺസർവേഷനെയും പുനഃക്രമീകരണത്തെയും കുറിച്ചുള്ള വിവരങ്ങൾ നൽകുന്നു, നാല് കോളിനിയർ ബ്ലോക്കുകൾ കാണിക്കുന്നു, കൂടാതെ ജീനോം ട്രാൻസ്‌ലോക്കേഷന്റെയോ വിപരീതത്തിന്റെയോ ലക്ഷണങ്ങളൊന്നുമില്ല. കൂടാതെ, അമിനോ ആസിഡ് സീക്വൻസുമായുള്ള പൂരക വിശകലനം എല്ലാ പൂർണ്ണ ജീനോമുകളിലും ഹോമോളജി തെളിയിച്ചു, കൂടാതെ narX അല്ലെങ്കിൽ pks12-ന്റെ തൊട്ടടുത്ത പ്രദേശങ്ങളിൽ PE/PPE കണ്ടെത്തിയില്ല. narX-ന്, ഒരു ജീനോമിന് (Mb0030) കുറഞ്ഞ പര്യായ സ്കോർ ഉണ്ട്, കാരണം narX ജീൻ രണ്ട് ശകലങ്ങളായി തിരിച്ചറിഞ്ഞു (fragments 1891 ഉം 1890 ഉം). pks12 ന്, സമാനതകൾ കാരണം, Mb0030 ഉം Mb003 ഉം കുറഞ്ഞ സിൻലീനിയാരിറ്റി സ്കോറുകൾ കാണിച്ചു, അതേസമയം pks12 യഥാക്രമം രണ്ട്, മൂന്ന് ഭാഗങ്ങളായി തിരിച്ചറിഞ്ഞു, അവ പ്രോട്ടീന്റെ വ്യത്യസ്ത ഡൊമെയ്‌നുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു (അനുബന്ധ ചിത്രം 3-5). ഈ വിവരങ്ങൾ കണക്കിലെടുത്ത്, ഗബ്ബിൻസും RDP4 സോഫ്റ്റ്‌വെയറും വിശകലനം നടത്തി, വിൻഡോയിൽ പരമാവധി 500 bp യുടെ കോർ മൾട്ടിപ്പിൾ അലൈൻമെന്റ് പരിശോധിക്കുക, PE/PPE ജീൻ narX ഉം pks12 ഉം ബാധിക്കുന്ന റീകോമ്പിനേഷൻ സിഗ്നലിൽ ഇടപെടില്ലെന്ന് ഞങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു.
ഈ ഡാറ്റാ സെറ്റിൽ കണ്ടെത്തിയ പുനഃസംയോജന സിഗ്നലുകൾ അവശിഷ്ടമായി കണക്കാക്കാമെങ്കിലും, എം. ബോവിസിലെ പുനഃസംയോജനം തള്ളിക്കളയാനാവില്ല എന്നത് ശരിയാണ്, അതിനാൽ ഇത് കൂടുതൽ വിശകലനത്തിന് വിഷയമായി തുടരണം, അതിൽ വ്യത്യസ്ത എപ്പിഡെമിയോളജിക്കൽ സാഹചര്യങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള മുഴുവൻ ജീനോമുകളും പ്രധാനമായി ക്രമീകരിച്ചിരിക്കുന്നു.
പുനഃസംയോജന തിരുത്തലിന് മുമ്പും ശേഷവും ലഭിച്ച ML ഫൈലോജെനെറ്റിക് മരങ്ങളെ താരതമ്യം ചെയ്തത് (ചിത്രം 2A, B) അനുമാനിച്ച ഫൈലോജെനെറ്റിക് ബന്ധത്തിൽ കാര്യമായ മാറ്റങ്ങൾക്ക് കാരണമായില്ല, കൂടാതെ M. ബോവിസ് സ്ട്രെയിനുകൾ ഒരേ ഗ്രൂപ്പിൽ കൂട്ടമായി ഉണ്ടായിരുന്നു.
M. bovis AF2122/97 ന്റെ റഫറൻസ് ജീനോം ഉപയോഗിച്ച് പുതുതായി ക്രമീകരിച്ച 42 M. bovis റീഡുകൾ മാപ്പ് ചെയ്ത ശേഷം, 1816 പോളിമോർഫിക് സ്ഥാനങ്ങൾ അടങ്ങിയ ഒരു SNP അലൈൻമെന്റ് ലഭിച്ചു. മിക്ക SNP-കളും (87.1%) കോഡിംഗ് മേഖലയിലാണ് സ്ഥിതി ചെയ്യുന്നത്, കൂടാതെ ബാധിച്ച ജീനുകളെ Bovilist-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്ന ഫങ്ഷണൽ വിഭാഗങ്ങൾക്കനുസൃതമായി വിശേഷിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം 6A, B). ഓരോ ഫങ്ഷണൽ വിഭാഗത്തിലെയും ആകെ ജീനുകളുടെ എണ്ണം കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, "ലിപിഡ് മെറ്റബോളിസം" വിഭാഗത്തിലെ ജീനുകൾ കൂടുതൽ SNP-കൾ കാണിച്ചു, തുടർന്ന് "കോശഭിത്തിയും കോശ പ്രക്രിയകളും", "ഇന്റർമീഡിയറ്റ് മെറ്റബോളിസവും ശ്വസനവും" എന്നിവ കാണിച്ചു, അവ M. bovis പരിണാമത്തിലാണെന്ന് വെളിപ്പെടുത്തി.
പോർച്ചുഗലിൽ നിന്നുള്ള എം. ബോവിസ് ഡാറ്റാസെറ്റിന്റെ ശ്രേണിപരമായ വിശകലനം (n = 42). ഓരോ ഫങ്ഷണൽ വിഭാഗത്തിനും (എ) രജിസ്റ്റർ ചെയ്ത എസ്എൻപികളുടെയും ബാധിച്ച ജീനുകളുടെയും ആകെ എണ്ണം. ഫങ്ഷൻ വിഭാഗം (ബി) രജിസ്റ്റർ ചെയ്ത പര്യായവും അപരവുമായ മാറ്റങ്ങളുടെ ആകെ എണ്ണം.
ആഗോളതലത്തിൽ, ശരാശരി dN/dS അനുപാതം 1.5 നേക്കാൾ മികച്ചതാണ്, ഇത് ആഗോള പരിണാമ സമ്മർദ്ദം പൂർവ്വിക അവസ്ഥയിൽ നിന്ന് മുക്തി നേടാനുള്ളതാണെന്നും ഒരു പോസിറ്റീവ് (വൈവിധ്യവൽക്കരിക്കപ്പെട്ടതോ സംവിധാനം ചെയ്തതോ ആയ) കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ വിശ്രമിച്ച ശുദ്ധീകരണ തിരഞ്ഞെടുപ്പിനെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നുവെന്നും സൂചിപ്പിക്കുന്നു. "വൈറലൻസ്, വിഷവിമുക്തമാക്കൽ, പൊരുത്തപ്പെടുത്തൽ", "ഇൻസേർഷൻ സീക്വൻസുകളും ഫേജുകളും", "റെഗുലേറ്ററി പ്രോട്ടീനുകൾ" എന്നീ വിഭാഗങ്ങളിൽ, SNP-കളിൽ മൂന്നിൽ രണ്ട് ഭാഗവും പര്യായങ്ങളല്ല (ചിത്രം 6B).
എല്ലാ വിഭാഗങ്ങളിലും, ഒന്നിലധികം SNP-കളുള്ള ജീനുകൾ ഉണ്ട്, അതിന്റെ ഫലമായി ശരാശരി മ്യൂട്ടേഷൻ നിരക്ക് (അതായത്, ഒരു ജീനിന് ശരാശരി SNP) 1-ൽ കൂടുതലാണ് (ചിത്രം 6A). 15 SNP-കളുള്ള Pks12 (Mb2074c) ഉം 8 SNP-കളുള്ള fas (Mb2553c) ഉം ഉയർന്ന മ്യൂട്ടേഷൻ മൂല്യങ്ങൾ ഉള്ളവയാണ്. ഈ രണ്ട് ജീനുകളും ഫാറ്റി ആസിഡ് മെറ്റബോളിസത്തിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു. മൈകോബാക്ടീരിയൽ സെൽ വാൾ ലിപിഡ് ബയോസിന്തസിസിൽ ഉൾപ്പെടുന്ന ഒരു മൾട്ടിഫങ്ഷണൽ എൻസൈമായ പോളികെറ്റൈഡ് സിന്തേസ് (PKS) pks ജീൻ എൻകോഡ് ചെയ്യുന്നു. മൈകോകെറ്റൈഡുകളുടെ സിന്തസിസിൽ ഉൾപ്പെടുന്ന ഒരു മൾട്ടിഫങ്ഷണൽ പോളിപെപ്റ്റൈഡിനെ ഈ ജീൻ എൻകോഡ് ചെയ്യുന്നു. മൈക്കോളിക് ആസിഡിന്റെ സിന്തസിസിൽ ഫാസ് ജീൻ ഉൾപ്പെടുന്നു. ഹോസ്റ്റുമായി സമ്പർക്കത്തിൽ സെൽ വാളിന്റെ ബയോസിന്തസിസിൽ ഈ രണ്ട് ജീനുകളും ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നു.
മൈകോബാക്ടീരിയം ബോവിസിന്റെ പരിണാമത്തെ കുറിച്ച് കൂടുതൽ പഠിക്കുന്നതിനായി, രണ്ട് സെറ്റ് നിർദ്ദിഷ്ട ജീനുകൾ വിശകലനം ചെയ്തു. സീക്വൻസ് കോമ്പോസിഷനും ഫൈലോജെനെറ്റിക് രീതികളും ഉപയോഗിച്ച് മുമ്പ് പ്രസിദ്ധീകരിച്ച കൃതികൾ വൈവിധ്യവൽക്കരണത്തിന് മുമ്പ് MTBC പൂർവ്വികർ HGT വഴി നേടിയ ജീനുകളെ തിരിച്ചറിഞ്ഞു37,38. ഈ ജീനുകൾ സപ്ലിമെന്ററി പട്ടിക 2 ൽ പട്ടികപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്. HGT യുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കാവുന്ന ആകെ 77 ജീനുകളുടെ SNP വിതരണം വിശകലനം ചെയ്തു, 26 പോളിമോർഫിക് സൈറ്റുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു, ഇത് മിക്ക കേസുകളിലും (78%) പര്യായമല്ലാത്ത (NS) മാറ്റങ്ങൾക്ക് കാരണമായി (സപ്ലിമെന്ററി പട്ടിക 2). MTBC ജീനോമിനെക്കുറിച്ചുള്ള മുൻകാല പ്രവർത്തനങ്ങൾ, മറ്റ് ജീനോമുകളെ അപേക്ഷിച്ച്, അനുമാന HGT മേഖല ഉയർന്ന NS SNP അനുപാതം പ്രകടിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് തെളിയിച്ചു. ഈ പുനഃസംയോജന മേഖലകൾ MTBC പൂർവ്വികർ നേടിയെടുത്തതാണെന്നും അതിനാൽ, അവ പുരാതന പോളിമോർഫിസങ്ങളെ അമിതമായി പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നുവെന്നും ഒരാൾ കരുതുന്നുവെങ്കിൽ, പര്യായ മാറ്റങ്ങളുടെ അനുപാതം കൂടുതലായിരിക്കുമെന്ന് പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു, കാരണം അമിനോ ആസിഡ് മാറ്റങ്ങൾ കാരണം നെഗറ്റീവ് സെലക്ഷൻ വഴി NS പകരക്കാർ ഇല്ലാതാക്കപ്പെടുമെന്ന് പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു, ഇത് പ്രോട്ടീന്റെ പ്രവർത്തനത്തെ മാറ്റിയേക്കാം. അതിനാൽ, മൂല്യവത്തായ അഡാപ്റ്റീവ് ജനിതക വൈവിധ്യത്തിന് അവയുടെ പ്രാധാന്യത്തെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്ന HGT-സമാന ജീനുകൾ മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുന്നതിൽ നിന്ന് പ്രവർത്തനപരമായ അനന്തരഫലങ്ങൾ ഉണ്ടാകാമെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ഈ വിശകലനത്തിന് സമാന്തരമായി, 3R (DNA റിപ്പയർ, റെപ്ലിക്കേഷൻ, റീകോമ്പിനേഷൻ) സിസ്റ്റത്തിന്റെ ഘടകങ്ങളെ എൻകോഡ് ചെയ്യുന്ന ജീനുകൾ, dos Vultos ഉം collaborators ഉം (2008) മുമ്പ് പ്രസിദ്ധീകരിച്ച പട്ടികയ്ക്ക് അനുസൃതമായി സമഗ്രമായി പരിശോധിച്ചു. സമാനമായ DNA ശകലങ്ങളുടെ കൈമാറ്റം നേരിട്ട് നിരീക്ഷിക്കാൻ കഴിയില്ല, എന്നിരുന്നാലും അടുത്ത ബന്ധമുള്ള ബാക്ടീരിയകൾ ഉൾപ്പെടുമ്പോൾ ഇത് ഒരു പതിവ് പ്രക്രിയയായിരിക്കാം, ഉദാഹരണത്തിന് ഈ ഡാറ്റാ സെറ്റിന്റെ കാര്യത്തിൽ; കൂടാതെ, ഈ പ്രക്രിയ DNA റിപ്പയർ രീതികളുടെ താക്കോലായിരിക്കാം72, അതിനാൽ ഹോമോലോജസ് റീകോമ്പിനേഷനിൽ ഒരു പങ്ക് വഹിക്കുക. 54 ജീനുകൾ വിതരണം ചെയ്ത ആകെ 26 പോളിമോർഫിക് സ്ഥാനങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു (സപ്ലിമെന്ററി പട്ടിക 3). ഈ ജീനുകളുടെ കൂട്ടത്തിൽ, NS മാറ്റങ്ങൾ ഏകദേശം 65% അനന്തരഫലങ്ങൾക്കും കാരണമായി, ഇത് മൈകോബാക്ടീരിയം ട്യൂബർക്കുലോസിസ് സ്ട്രെയിനുകളെക്കുറിച്ചുള്ള മുൻ റിപ്പോർട്ടുകളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു.