Gràcies per visitar Nature. La versió del navegador que esteu utilitzant té compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu una versió més recent del navegador (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). Alhora, per garantir la compatibilitat continuada, mostrarem llocs web sense estils ni JavaScript.
La seqüenciació del genoma ha revitalitzat el camp de la investigació de malalties infeccioses, revelant l'epidemiologia de les malalties, la patogènesi, les interaccions hoste-patogen i el procés evolutiu imposat als patògens. El complex Mycobacterium tuberculosis (MTBC) considera Mycobacterium bovis com un dels seus membres adaptatius animals que causen tuberculosi (TB) en mamífers terrestres, i és un model típic d'evolució bacteriana. Com altres membres del MTBC, se suposa que Mycobacterium bovis és un patogen estrictament clonat i de lenta evolució, i òbviament no hi ha cap signe de recombinació o transferència horitzontal de gens. En aquest treball, apliquem la genòmica comparativa a un conjunt de dades de seqüència del genoma complet (WGS) compost per 70 M. bovins de diferents pedigrís (Europa i Àfrica) per obtenir informació sobre la diversitat genètica de M. bovina. Poder evolutiu. S'utilitzen tres mètodes diferents per estimar els signes de reorganització. A nivell mundial, s'ha identificat un petit nombre d'esdeveniments de recombinació i s'ha confirmat mitjançant dos mètodes independents amb un suport sòlid. No obstant això, en comparació amb les mutacions, la recombinació té un efecte més feble sobre la diversitat de M. bovis (r/m global = 0,037). La diferència r/m mitjana obtinguda en el complex clonal de Mycobacterium bovis en el nostre conjunt de dades és coherent amb el concepte general que el grau de recombinació pot variar molt entre els llinatges assignats a la mateixa espècie taxonòmica. Basant-nos en aquest treball, no es pot descartar la recombinació en Mycobacterium bovis, per la qual cosa hauria de ser objecte de més esforços en futures investigacions de genòmica comparativa, en què la WGS de grans conjunts de dades de diferents escenaris epidemiològics d'arreu del món és crucial. A continuació, es va realitzar una anàlisi addicional sobre el conjunt de dades més petit de Mycobacterium bovis (n = 42) a partir de la prevalença de tuberculosi multihoste, i es van identificar més de 1.800 loci, dels quals almenys una soca mostrava un polimorfisme de nucleòtid únic (SNP). La majoria (87,1%) es troben a la regió codificant, i la proporció global de canvis no sinònims (dN/dS) de canvis sinònims supera 1,5, cosa que indica que la selecció positiva és una força evolutiva important exercida sobre M. bovis. Es va detectar una proporció més alta de SNP en gens rics en categories funcionals de "metabolisme lipídic", "processos cel·lulars i de la paret cel·lular" i "metabolisme i respiració intermedis", cosa que revela el seu potencial en la biologia i l'evolució de la importància de Mycobacterium bovis. Una mirada més detallada als gens dels avantpassats MTBC que són propensos a la transferència horitzontal de gens i inclosos en el sistema 3R (reparació, replicació i recombinació de l'ADN) revela el valor negatiu mitjà global de la prova D neutra de Taijima, que indica una exploració selectiva passada. El recent coll d'ampolla després de l'expansió de la població continua sent el principal factor impulsor evolutiu perquè el patogen obligatori Mycobacterium bovis lluiti contra l'hoste.
El complex Mycobacterium tuberculosis (MTBC) és un dels tàxons més reeixits de patògens bacterians i un cas típic d'evolució bacteriana. Els seus membres mostren una identitat de nucleòtids sorprenentment alta a nivell genòmic (> 99%)1,2. Diferents ecotipus de MTBC poden causar tuberculosi (TB), que és una malaltia granulomatosa infecciosa, en una àmplia gamma d'espècies hostes, des de micromamífers fins a humans3,4,5. Actualment, el complex inclou humans [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] i patògens adaptats als animals (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" i "dassie")5,6. M. canettii (també conegut com a "Nodobacter glabrata") La identitat mitjana de nucleòtids amb els micobacteris esmentats és del 98%, i els treballs de genòmica comparativa han demostrat que M. canettii i la resta de MTBC han divergit recentment de l'avantpassat comú.7 Tenint en compte aquest concepte, alguns autors anomenen M. canettii Membre de MTBC 8.
El MTBC es descriu sistemàticament com un complex clonal estricte, i la seva estructura poblacional està clarament governada per una diversitat reduïda, colls d'ampolla, escaneig selectiu i deriva genètica9,10. Assumint que l'evolució clonal estricta complexa, com ara els polimorfismes perduts, no es pot restaurar mitjançant recombinació. Basant-se en aquesta premissa, s'han proposat els esdeveniments consecutius de la deleció genòmica de la regió diferencial (RD) i TbD1 (regió de deleció específica de Mtb 1) com a marcadors moleculars de l'evolució del MTBC2,5,11. El treball de genòmica comparativa i seqüenciació del genoma complet (WGS) dóna suport a la divisió dels membres adaptats als humans en nou llinatges (Mycobacterium tuberculosis L1 a L4, L7 i L8; i Mycobacterium africanum L5, L6 i L9), els llinatges L2 a L4 compartien la regió de deleció de TbD12,11,12,13. A més, es proposa que els membres adaptats als animals comparteixin un avantpassat comú, que es defineix per delecions específiques del clade a RD7, RD8, RD9 i RD102, 5 i 14.
La transferència horitzontal de gens (THG) i els esdeveniments de recombinació es consideren rars i es produeixen en els avantpassats dels MTBC, en lloc de la història diferent de tot el membre del MTBC15,16,17. Dos informes preliminars de Hughes i col·laboradors (2002) i Gutacker i col·laboradors (2006) van suggerir que els esdeveniments de recombinació poden ajudar a donar forma a polimorfismes que marquen loci específics en soques de M. tuberculosis18,19. Les raons de la manca òbvia de recombinació en el MTBC són: (1) el procés mecànic i la pèrdua de capacitat de la TGH; (2) la raresa dels esdeveniments de TGH; (3) no hi ha possibilitat d'esdeveniments de recombinació en el nínxol del MTBC14,17. Recentment, alguns estudis de seqüenciació del genoma complet (WGS) aplicats a la soca 20 de MTBC i a Mycobacterium bovis 21 han proporcionat proves de recombinació, els primers a mostrar que les soques de MTBC sovint intercanvien petits fragments d'ADN, però a causa de la variació limitada de la seqüència de nucleòtids, aquests esdeveniments encara no s'han notat.
Mycobacterium bovis és el membre del MTBC que es recupera més comunament del bestiar (principalment bestiar boví), tot i que també es pot aïllar d'animals salvatges en llibertat i en tanques4,22,23,24. M. bovis va evolucionar en cinc complexos clonals principals [Europeu 1 (Eu1), Europeu 2 (Eu2), Europeu 3 (Eu3), Africà 1 (Af1) i Àfrica 2 (Af2)], segons el perfil d'espoligotipificació, delecions específiques i polimorfismes de nucleòtid únic (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 en gens específics. Aquests complexos clonals demostren l'estructura diversa de la població de Mycobacterium bovis i la seva associació amb regions geogràfiques. A més, el treball recent de WGS dut a terme per Zimpel i els seus col·laboradors (2020) va dissenyar una filogènia basada en el SNP de Mycobacterium bovis, amb més de 1.900 genomes, cosa que indica que hi ha almenys quatre llinatges diferents (anomenats Lb1 a Lb1 a Lb4), que no són completament consistents amb el complex clonal definit anteriorment, tot i que també es pot confirmar l'especificitat geogràfica30. Aquests autors van realitzar anàlisis diferencials de la filogènia i la datació molecular, però no van estudiar la recombinació30.
Treballs previs utilitzant diferents tècniques moleculars, com ara l'espoligotipificació, el MIRU-VNTR (unitat de repetició intercalada de micobacteris - nombre variable de repeticions en tàndem) i la tipificació recent de SNP han revelat un cert nivell de diversitat genètica entre les soques de M. bovis 31,32,33, 34,35. La diferenciació de la variació genètica s'ha convertit en una eina important en l'estudi de l'epidemiologia de malalties, que és útil per a una comprensió profunda de la patogènesi, la virulència i la transmissió de malalties. L'aparició del mètode WGS ofereix la possibilitat de revelar els factors impulsors evolutius imposats pel genoma de Mycobacterium bovis en el procés d'adaptació i persistència a diferents hostes i escenaris epidemiològics.
En aquest treball, utilitzem l'anàlisi genòmica comparativa de diversos conjunts de dades de Mycoplasma bovis (n = 70), incloent-hi aïllats de diferents complexos clonals, per obtenir informació sobre el procés evolutiu de Mycoplasma bovis, especialment per resoldre relacions filogenètiques i esdeveniments de recombinació. Com a complement d'aquesta anàlisi, es va explorar més a fons un subconjunt de dades d'aïllats de M. bovis (n = 42) obtinguts d'una zona de tuberculosi multihoste ben caracteritzada a Portugal 31,36 per inferir la no-identitat. L'equilibri entre la relació relativa de substitucions de nucleòtids amb sentit (dN) i sinònimes (dS), així com la contribució evolutiva de genomes específics esmentats a la literatura, que són 37,38 obtinguts pels avantpassats del MTBC mitjançant HGT i codifiquen components gènics del sistema 3R (reparació, replicació i recombinació de l'ADN) 39. Escollim els gens obtinguts mitjançant HGT perquè poden representar polimorfismes antics, per la qual cosa s'espera que puguin contenir una proporció més alta de canvis sinònims. Els gens inclosos en el sistema 3R es van seleccionar perquè treballs previs sobre soques de M. tuberculosis indicaven seleccions generals negatives/de purificació que funcionen sobre aquests gens, i que poden tenir un paper important en l'evolució 39. Un altre objectiu d'aquest treball és inferir l'existència d'esdeveniments de reorganització. Per aquest motiu, considerant que el nostre conjunt de dades de Portugal només conté els genomes del complex clonal europeu 2 i les soques que no tenen assignat el complex clonal, vam decidir incloure dades genòmiques disponibles públicament per obtenir finalment un representant de tots els complexos clonals i millorar la robustesa i l'amplitud dels resultats.
42 genomes de Mycoplasma bovis recentment seqüenciats de l'escenari de tuberculosi multihoste endèmica portuguesa (detalls a continuació), prèviament caracteritzats des d'una perspectiva epidemiològica36, són el centre d'aquest treball. Tenint en compte que el conjunt de dades de Portugal només té representants dels complexos de clons europeus 2 i soques sense complexos designats, s'han afegit dades de seqüenciació del genoma complet disponibles públicament per ampliar el conjunt de dades que inclou tots els representants dels complexos de clons de M. bovis. Per tant, en aquest treball s'han utilitzat tres fonts de dades de seqüenciació del genoma complet: assemblatge del genoma complet/esborrany, fins a 10 bastides emmagatzemades al NCBI (Centre Nacional d'Informació Biotecnològica) (n = 15 aïllats); emmagatzemades a SRA (el fitxer Illumina fastq de l'arxiu de lectura de seqüències) representa la diversitat complexa dels clons de M. bovis (n = 12 aïllats)30; i 42 genomes recentment seqüenciats de Portugal. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) es va excloure de la cerca del NCBI. M. bovis AF2122/97 s'utilitza normalment com a genoma de referència per incloure al conjunt de dades. A causa de la indisponibilitat pública de la seqüència completa del genoma representada pel complex de clonació African 1, i el petit nombre de genomes de soques representatives d'Af2 i Eu1, en aquests casos es van utilitzar les dades de seqüenciació originals proporcionades per SRA. El treball de Zimpel i els seus col·laboradors (2020) va ajudar a identificar el genoma del complex de clonació esmentat anteriorment i va ajudar a seleccionar Mycobacterium bovis per incloure-lo al conjunt de dades. Per a Eu3, només es descriu un tipus de genoma (Branger et al., 2020), de manera que el genoma que incloem és un representant separat del complex Eu3.
A nivell mundial, aquest conjunt de dades inclou 70 M. bovis de bestiar aïllats de 8 espècies hostes, distribuïdes en 12 països des del 1985 fins al 2016. 36 espècies estan designades com a Eu2, 7 espècies són Eu1, 1 espècie és Eu3, 3 espècies són Af1, 4 espècies són Af2 i 19 no són atribuïbles a cap complex clonal (detalls a continuació). La informació detallada (inclòs el número d'accés) de Mycobacterium bovis utilitzada en aquest estudi es mostra a la Taula 1 i a la Taula Suplementària 1.
42 genomes complets recentment seqüenciats de Mycobacterium bovis dels punts crítics de tuberculosi animal de Portugal i distribuïts durant més de 12 anys són el centre d'aquest estudi, ja que els possibles sistemes de malalties entre la fauna salvatge i el bestiar s'han monitoritzat regularment 31,36 (Fig. suplementària 1). Segons procediments posteriors, aquestes soques es van aïllar de bestiar boví (n = 14), cérvol vermell (n = 16) i senglar (n = 12) del 2003 al 2015: recollir i manipular els animals d'acord amb les directrius del protocol recomanades. Les mostres de teixit es troben al Manual d'Animals Terrestres de l'OIE i s'inoculen en un medi sòlid de piruvat Stonebrink i Löwenstein-Jensen i un medi líquid. Els cultius s'incuben a 37 °C i el creixement es comprova un cop per setmana durant almenys 12 setmanes. Les colònies s'emmagatzemen directament en una solució de glicerol a -80 ºC. En el medi selectiu per a Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), les mostres arxivades originals es van passar per un únic passatge in vitro per obtenir l'ADN del programa WGS. Per a això, la solució de cultiu congelat es va enriquir amb piruvat de sodi al 5% i ADS al 10% (50 g d'albúmina, 20 g de glucosa, 8,5 g de clorur de sodi en 1 L d'aigua) en Middlebrook 7H9 a 37 °C. Després de 4 setmanes de creixement, es va renovar el medi i es va controlar regularment el cultiu fins que es va observar el creixement. Les cèl·lules es van recollir per centrifugació, el pellet es va resuspendre en 500 µL de solució salina tamponada amb fosfat (PBS), es va escalfar a 99 °C durant 30 minuts, es va centrifugar i el sobrenedant es va emmagatzemar a -20 °C fins a la WGS. Tots els procediments es duen a terme en instal·lacions de bioseguretat de nivell 3.
La biblioteca de genomes d'extrems aparellats WGS es prepara utilitzant l'índex únic de cada mostra d'ADN i utilitza la tecnologia Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 mostres) i HiSeq (2 × 150 pb) (dos aïllats) (Eurofins Genomics, Alemanya) per a la seqüenciació. Segons les instruccions del fabricant, utilitzeu l'analitzador de genomes Illumina amb mòdul de doble extrem per seqüenciar l'ADN genòmic i utilitzeu el kit de preparació de la biblioteca d'ADN Nextera XT d'Illumina per construir la biblioteca.
Tenint en compte les dades recuperades de l'SRA (n = 12), la identificació del complex clonal es pot utilitzar com a metadades de la publicació corresponent 30, 41, 43. Quan es considera el genoma complet, excepte per a Mycobacterium bovis AF2122/97 i Mycobacterium bovis 3601, que són membres reconeguts del complex clonal Eu1 i Eu3 25, 29, respectivament, és el mateix que el genoma complet de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (número d'accés del NCBI NC_000962.3). L'alineació del genoma es realitza mitjançant MAFFT (programa d'alineació múltiple de seqüències d'aminoàcids o nucleòtids, versió 7.458) i el paràmetre -addfragments48. A continuació, es busca l'absència de diferents complexos clonals i/o la presència de característiques SNP.
El Mycobacterium bovis recentment seqüenciat (n = 42) i les lectures originals de l'esborrany del genoma assemblat (n = 3) alineen el complex amb el genoma de referència Mycobacterium tuberculosis H37Rv a través del pipeline vSNP i la presència de la deleció i/o característiques SNP de diferents clons. Es va dur a terme una cerca.
Recopilar informació a partir de la manca de característiques i/o la presència/absència de perfils de SNP i d'espoligotipificació per assignar dades genòmiques al complex clonal corresponent. Per als quatre esborranys d'assemblatges, el perfil d'espoligotipificació no es pot inferir, per la qual cosa s'inclouen al grup "sense complexitat".
El flux de treball bioinformàtic seguit per aquest treball comença des de l'assemblatge de novo i el mapatge a una estratègia de referència, amb l'objectiu d'explorar esdeveniments de recombinació i polimorfismes genòmics específics. La Figura 1 proporciona un diagrama de flux dels passos seguits. Per a l'anàlisi de recombinació, s'utilitzen tots els genomes per augmentar la robustesa de les inferències i els indicadors relacionats.
Per tal de reduir els errors en la generació de seqüències de consens del genoma, primer vam obtenir un assemblatge de novo i després vam obtenir alineaments múltiples bàsics. El pipeline Unicycler està actualment disponible a https://github.com/rrwick/Unicycler49 i s'utilitza per realitzar l'assemblatge de novo de 54 genomes seqüenciats (42 recentment seqüenciats i 12 fitxers fastq recuperats de SRA). En resum, abans de l'assemblatge des de zero, es va realitzar una anàlisi de la qualitat de lectura a FastQC versió 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) i Trimmomatic versió 0.36 (s'aplica l'opció "tallar adaptadors i altres seqüències específiques de la il·luminació a partir de lectures" i "Tallar bases des del final de la lectura, si la qualitat llindar és inferior a 20") (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. A continuació, es va utilitzar SPAdes optimizer49 per a l'assemblatge del genoma i Pilon versió 1.1851 per a l'optimització post-assemblatge. Es va seleccionar un mode de pont conservador per evitar un acoblament incorrecte, i es va cercar i seleccionar la mida del k-mer entre el 20% i el 95% de la longitud de lectura. Seguiu les pautes de les SPAdes i considereu la mida de lectura, suprimiu els contigs menors de 300 bp i establiu un límit de cobertura de profunditat de lectura de 20 de 52. En l'estratègia d'acoblament de novo, no es van eliminar les regions genòmiques com ara els paràlegs altament repetitius de prolina-glutamat (PE) i prolina-prolina glutamat (PPE).
La qualitat del muntatge de novo s'avalua mitjançant el pipeline QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), que facilita la renovació del contig i el mapatge del genoma de referència de M. bovis AF2122/97 (número d'accés del NCBI LT708304.1) (vegeu la taula suplementària 1 per als paràmetres de qualitat).
Amb l'ajuda del pipeline vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), el fitxer FASTQ del M. bovis recentment seqüenciat a partir de la seqüenciació d'Illumina es compara amb el genoma de referència de M. bovis AF2122/97 (LT708304.1). D'acord amb les recomanacions de bones pràctiques del Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55, apliqueu paràmetres de filtre estàndard o puntuacions de massa variant per a la recalibratge. Els resultats es filtren utilitzant la puntuació de massa més baixa de SAMtools de 150 i AC = 2. També utilitzeu Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) per comprovar les lectures per descartar la contaminació. El pipeline vSNP utilitzat per mapejar estratègies de seqüència en el nostre treball examina una sèrie de SNP i objectius definits, i també exclou escenaris d'infecció mixta. La cobertura del genoma llegit és superior al 99% (Taula suplementària 1).
Per evitar errors de mapatge i SNP incorrectes, filtreu una variant en els casos següents: (1) està compatible amb menys de 20 lectures, (2) es troba amb una freqüència inferior a 0,9, (3) es troba en almenys una soca, però almenys hi ha buits en una altra soca. El visor de genòmica integrat (IGV) versió 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 es va utilitzar per verificar visualment els SNP i les posicions amb problemes de mapatge o alineació. Com que els gens prolina-glutamat (PE) i prolina-prolina glutamat (PPE) estan altament duplicats i formen part d'una família multigènica, són fàcilment malinterpretats per la seqüenciació i els errors de mapatge d'Illumina, per la qual cosa es prefereixen. El flux de treball de bioinformàtica micobacteriana va eliminar els membres del complex de la tuberculosi quan s'utilitzava l'estratègia de mapatge a seqüència per confirmar els SNP. Per tant, vam filtrar els gens PE/PPE i les indels de l'anàlisi.
Segons Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), tots els SNP es divideixen en categories funcionals. El pipeline SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) s'utilitza per inferir les conseqüències dels SNP (canvis sinònims o no sinònims). S'ha creat una nova base de dades del genoma de Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
L'alineament múltiple del genoma central es va dur a terme utilitzant Parsnp v1.2, actualment disponible a https://github.com/marbl/parsnp57, utilitzant 69 genomes complets/esborranys d'assemblatges (amb l'opció -c) i s'utilitza M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) com a referència. Es van realitzar quatre alineaments múltiples centrals: només els membres del complex de clonació Eu2 (n = 37), incloent-hi tots els membres del complex de clonació europeu (n = 44), incloent-hi el punt d'unió del complex de clonació europeu i africà (n = 51), i incloent-hi tot Mycobacterium bovis en aquest estudi (n = 70).
L'alineació central generada per Parsnp s'utilitza per inferir l'arbre filogenètic de màxima probabilitat (ML) utilitzant CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 utilitzant RAxML, i realitzar 1000 replicacions guiades.
S'utilitzen tres algoritmes i eines bioinformàtiques diferents per comprovar la presència d'esdeveniments de recombinació en paral·lel: el programari SplitsTree4, el pipeline Gubbins (llinatge imparcial a través de la recombinació en seqüències de nucleòtids) i el programari RDP4 (programa de detecció de recombinació, versió beta 4.101).
El mètode de descomposició dividida implementat a SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 s'utilitza per calcular la xarxa filogenètica sense arrels, utilitzant la prova Phi per a la verificació estadística, i el llindar de significació és p = 0,05. L'anàlisi multi-alineació central de Parsnp s'utilitza com a entrada i es realitza la descomposició dividida com a estàndard de xarxa.
El pipeline de Gubbins v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) s'executa amb paràmetres per defecte com una altra manera d'avaluar l'impacte de la recombinació en Mycobacterium bovis. L'algoritme implementat al pipeline reconstrueix el llinatge clonal rellevant. L'assemblatge complet del genoma/esborrany del nostre conjunt de dades i el genoma de referència (bòvid boví AF2122/97, LT708304.1) es troben mútuament; i escanegen la posició de l'SNP a cada branca de l'arbre per detectar el clúster d'SNP que representa l'esdeveniment de recombinació. El zero de la branca. Suposem que no hi ha cap esdeveniment de recombinació, la qual cosa significa que els SNP que es produeixen a la branca haurien d'estar distribuïts uniformement. L'alineació múltiple central de Parsnp i l'arbre ML amb la millor puntuació de RAxML s'utilitzen com a fitxers d'entrada.
Finalment, per tal de confirmar l'esdeveniment de reorganització suggerit pel pipeline de Gubbins, els sis algoritmes implementats a RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 i SiScan66) s'apliquen a l'alineament múltiple central de Parsnp amb la configuració predeterminada. Vam determinar que almenys tres dels algoritmes implementats a RDP4 han de demostrar consistentment un senyal important per verificar cada esdeveniment de recombinació.
Tenint en compte que tant el programari Gubbins com el RDP busquen senyals de recombinació comprovant els alineaments múltiples del nucli en una finestra de fins a 500 pb, i confirmant que la inclusió de gens PE/PPE durant l'assemblatge de novo no interferirà amb els senyals de recombinació trobats, es fa una anàlisi addicional mitjançant homolinealitat. Comproveu la proximitat del gen que identifica l'esdeveniment de recombinació. El mapa sinlineal utilitzant el genoma complet es va construir mitjançant l'alineació MAUVE-multi-genome (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) per excloure translocacions o inversions locals del genoma. A més, es va utilitzar tot el genoma per realitzar anàlisis d'homolinealitat de la seqüència d'aminoàcids a través del servidor web SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Una anàlisi més detallada del conjunt de dades del genoma obtingudes del sistema portuguès de tuberculosi multihoste consisteix a comprovar el polimorfisme dels gens esmentats a la literatura. Aquests gens són 37, 38 i el gen que codifica 3R obtingut pels avantpassats del MTBC mitjançant components del sistema HGT (reparació, replicació i recombinació de l'ADN) 39. Utilitzeu ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) i utilitzeu DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) per calcular la diversitat gènica i la diversitat de nucleòtids (π) i l'entrada del paràmetre de prova D neutre de Tajima.
Es va obtenir un arbre filogenètic de màxima probabilitat (ML) basat en 69 aïllats de Mycoplasma bovis i genomes de referència (Figura 2A). En comparació amb els arbres basats en un sol gen o els arbres basats en múltiples locus, aquesta estratègia permet la generació d'arbres més potents que no capturen la variabilitat de tot el genoma i, per tant, presenten una menor capacitat per discriminar entre espècies 68,69. L'estructura topològica de l'arbre ML sol ser coherent amb la classificació complexa dels clons. El genoma d'Eu2 està agrupat en una branca, i el genoma d'Af1 també està agrupat (Figura 2A). El resultat també és coherent amb la relació evolutiva coneguda de Mycobacterium bovis, és a dir, hi ha una gran diferència entre el membre d'Eu1 i el grup que consisteix en tots els altres complexos i genomes clonals, però el complex clonal 30 no s'especifica. La petita inconsistència entre el complex clonal i la relació observada a l'arbre filogenètic es pot explicar pel fet que el complex clonal es descriu a partir de regions genòmiques específiques, mentre que l'arbre filogenètic es basa en múltiples alineacions de genomes principals que representen tot el genoma.
L'arbre filogenètic de màxima probabilitat (GTR) es construeix basant-se en l'alineació del genoma central de Mycobacterium bovis abans (A) i després (B) de l'eliminació del lloc de recombinació. Els colors de les branques representen el complex clonal de Mycobacterium bovis: Europa 1 és morat, Europa 2 és vermell, Europa 3 és blau, Àfrica 1 és taronja i Àfrica 2 és verd. L'arbre té les arrels i està dibuixat a escala, i la longitud de la branca es mesura com a substitut de cada lloc.
El complex Mycobacterium tuberculosis es descriu com a evolucionat clonalment, i la majoria de les proves acumulades al llarg dels anys donen suport a la idea que els esdeveniments de HGT i recombinació en curs no es produiran al nivell detectable de MTBC15,17,18.
Treballs anteriors han demostrat que pot haver-hi una recombinació limitada entre les soques de MTBC20,21, mentre que altres no han aconseguit identificar esdeveniments de recombinació mesurables70,71. Torneu a discutir aquest tema centrant-vos en Mycobacterium bovis, que és diferent del treball anterior que només considerava Mycobacterium tuberculosis70,71; o considereu el MTBC en conjunt, gairebé sense M. bovis representant 20; o només considereu les fraccions restrictives de bestiar. El conjunt de dades de micobacteris, en aquest treball, hi ha un total de 70 soques, que representen tots els complexos clonals, utilitzades per detectar la recombinació. El conjunt de dades s'escala segons quatre nivells acumulatius: (1) membres d'Eu2, (2) tots els membres del complex clonal europeu (és a dir, Europa), (3) complex clonal europeu i africà (Eu + Af) i (4) totes les col·leccions de dades (inclosos els genomes que no estan inclosos en cap complex de clonació ja descrit).
Per estudiar més a fons aquesta hipòtesi, es va realitzar una xarxa de descomposició dividida per avaluar l'absència d'esdeveniments de recombinació entre genomes, ja que aquest mètode pot visualitzar la relació ancestral entre individus i mostrar senyals filogenètics contradictoris. Els quatre conjunts de dades de l'anàlisi van confirmar l'existència de bucles a la xarxa (és a dir, àrees que no convergeixen en un sol arbre), però la prova Phi no té suport estadístic (Eu2, p = 0,0956; Europa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; tot el conjunt de dades p = 0,2451), cosa que proporciona una evidència deficient de l'existència d'esdeveniments de reorganització (Figura 3A-D).
A Europa 2 genomes (n = 37) (A), genomes europeus (n = 44) (B), genomes europeus i africans (n = 51) (C) i tot el conjunt de dades (n = 70) (D).
Després d'aquesta anàlisi, i tenint en compte les observacions cícliques en totes les xarxes, es va aplicar l'algoritme de reconstrucció implementat a la cadena de producció de Gubbins per reconstruir el llinatge clonal i complementar l'estimació de l'efecte de la recombinació sobre el genoma de M. bovis. Inferir el nombre acumulatiu d'esdeveniments de recombinació, la majoria dels quals es van produir en branques terminals (és a dir, en un sol genoma) (Taula 2). Aquests indicadors mostren la consistència de tot el conjunt de dades i indiquen que la freqüència d'esdeveniments de recombinació és de 200 a 300 vegades superior a la de les mutacions. Un cop determinat, el paràmetre rho/theta que representa les taxes relatives de recombinació i mutacions puntuals a la branca sembla estar entre 0,0037 i 0,0056 (Taula 3). Recentment, el treball publicat de la soca 38 de M. bovis va demostrar un valor rho/theta més alt (rho/theta = 0,1) que l'obtingut en aquest conjunt de dades, però el treball de Patané i els seus col·legues va utilitzar l'assemblatge basat en referències per inferir paràmetres de recombinació. Un detall procedimental, a causa del procediment d'assemblatge, s'ha associat amb l'abundància de suposats esdeveniments de recombinació a la branca terminal.
A continuació, el paràmetre r/m representa la relació de diversitat de recombinació i introducció de mutacions, i el seu valor mitjà es troba entre 0,025 i 0,037, cosa que indica que, en comparació amb les mutacions, la recombinació té un impacte global menor en la diversitat genètica de M. bovis (Taula 3). Per a una comparació extensa, es va utilitzar un mètode similar per estimar el paràmetre r/m per al conjunt de dades MTBC compost per 23 genomes, mostrant un valor mitjà de 0,48620, mentre que per al conjunt de dades de 38 M. bovis de Patané i els seus col·legues, es va demostrar que el valor mitjà és de 0,98. En el primer estudi, només dos dels 23 genomes inclosos en el treball de M. bovis (M. bovis BCG i la soca de referència), de manera que el valor obtingut pot estar esbiaixat a causa de la sobreexpressió del genoma de M. tuberculosis. En el segon informe, les poblacions de Mycobacterium bovis analitzades es van recuperar principalment dels Estats Units i d'hostes ramaders. En canvi, en el nostre conjunt de dades, es representen més ubicacions geogràfiques i espècies hostes, i també s'utilitzen genomes agrupats en diferents complexos clonals amb diferents característiques genètiques de la població, aconseguint així un coneixement de la població més profund i ampli. La diferència de valor mitjà r/m obtinguda amb el nostre conjunt de dades és coherent amb el concepte que el grau de recombinació varia molt entre els llinatges assignats a la mateixa espècie taxonòmica, per la qual cosa aquests resultats indiquen que el complex clonal de M. bovis pot presentar diferències de recombinació. L'impacte també és el que suggereixen Didelot i Maiden72. No obstant això, ampliar significativament aquest conjunt de dades incloent-hi un nombre més gran de genomes de M. bovis permetrà aclarir encara més aquest punt. Tant els paràmetres r/m com rho/theta mostren variabilitat entre branques, i aquest resultat és coherent amb informes sobre altres espècies bacterianes72,73.
Finalment, per tal de confirmar els esdeveniments de reorganització identificats pel pipeline de Gubbins, es van utilitzar sis algoritmes diferents al programari RDP4 per provar independentment diferents multicomparacions bàsiques. Globalment, menys de la meitat dels esdeveniments identificats per Gubbins van ser confirmats per RDP4 (Taules 4 i 5). Considerant tot el conjunt de dades, es van confirmar tres esdeveniments de recombinació, dos que implicaven nodes interns i l'altre que implicava un sol genoma en una branca terminal, per al qual no es van poder assignar complexos clonals (Taules 4 i 5). La identificació d'esdeveniments a les branques terminals pot indicar que la recombinació encara està en curs en soques contemporànies de M. bovis o que el resultat està mal col·locat70. En aquesta hipotètica regió de recombinació, aproximadament el 20% de les posicions tenen nucleòtids (N) no definits, cosa que afecta el senyal de recombinació (Figura suplementària 2). A més, aquesta regió afecta el gen rrs, que codifica l'ARN ribosòmic 16S que s'espera que estigui altament conservat, de manera que aquest suposat senyal de recombinació pot ser el resultat d'errors de seqüenciació o desalineació. A continuació, es va realitzar l'alineament complet del genoma entre Mb0003 i Mycobacterium bovis AF2122/97, i es va confirmar l'existència de nucleòtids i SNPs no definits, de manera que els possibles problemes relacionats amb l'alineament incorrecte no eren deguts a la informació biològica implementada en aquest treball. Va aparèixer després d'aprendre el programa.
No es van trobar buits ni nucleòtids indefinits a les regions de recombinació dels nodes interns (figures 4 i 5). Pel que fa a aquests esdeveniments, un conté només el genoma Eu2 i afecta el gen pks12, que codifica una possible policètid sintasa; mentre que l'altre està registrat al genoma Eu1 i afecta el gen narX que codifica una possible nitrat reductasa (taula 4). En general, l'anàlisi de recombinació mostra que hi ha un nombre limitat de fragments de recombinació amb suport estadístic, i els indicadors inferits indiquen que la recombinació té un impacte baix en el llinatge de M. bovis. S'espera que el senyal de recombinació sigui baix, però és important distingir el veritable senyal d'evolució del soroll de fons, la qual cosa és una tasca difícil. Per tal de reduir el senyal de soroll introduït pels problemes d'assemblatge basats en referències i de desajustament 70, 71, tota la resta, excepte el genoma complet, es va assemblar des de zero, i la qualitat de l'assemblatge es va comprovar i garantir mitjançant l'anàlisi de la cadena de proves QUAST (taula suplementària 1). A més, es va dur a terme una sèrie d'anàlisis suplementàries per proporcionar la robustesa i la precisió de l'estudi general. Per tant, la qualitat de seqüenciació dels gens narX i pks12 es va avaluar mitjançant el mapatge de lectura contra Mycobacterium bovis AF2122/97. La posició recomanada de l'SNP a la regió de recombinació es va confirmar aplicant els criteris esmentats a la secció de mètode (almenys 20 lectures i una freqüència de canvi de 0,9). El polimorfisme del gen narX es va confirmar completament en els dos genomes (Mb1792361 i Mb7240415; 2,3%) i els genomes del genoma pks12: gens Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 i Mb12. Tanmateix, per al genoma Mb2043, sis de les vuit posicions no compleixen el criteri de profunditat de lectura perquè l'SNP està suportat per un màxim de 17 lectures, que està per sota del valor de tall establert de 20. Per tant, es pot confirmar la recombinació de sis genomes (8,6%) en aquest lloc del genoma (figures 4 i 5).
La visualització detallada de l'alineació de la regió de recombinació del conjunt de dades de Mycobacterium bovis afecta el gen narX que codifica una possible nitrat reductasa. No es van trobar buits ni nucleòtids no definits a la regió de recombinació dels nodes interns. Aquest esdeveniment particular està registrat al genoma Eu1. La qualitat de seqüenciació del gen narX es va avaluar representant gràficament les lectures de Mycobacterium bovis AF2122/97. Confirmeu la ubicació recomanada de l'SNP a l'àrea de recombinació aplicant els criteris esmentats a la secció de mètode (almenys 20 lectures i una freqüència de canvi de 0,9). El polimorfisme del gen narX es va confirmar completament en els genomes de Mb1792361 i Mb7240415 (2,3%).
Visualització detallada de l'alineació de la regió de recombinació del conjunt de dades de Mycoplasma bovis que afecta el gen pks12. No es van trobar buits ni nucleòtids no definits a la regió de recombinació dels nodes interns. Pel que fa a l'esdeveniment que afecta el gen pks12 que codifica la possible policètid sintasa, només conté el genoma Eu2. La qualitat de seqüenciació de pks12 es va avaluar mitjançant el mapatge de lectura de Mycobacterium bovis AF2122/97. Confirmeu la ubicació recomanada de l'SNP a l'àrea de recombinació aplicant els criteris esmentats a la secció de mètode (almenys 20 lectures i una freqüència de canvi de 0,9). Els polimorfismes dels genomes Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 i Mb1960 s'han confirmat completament.
Els gens PE i PPE tenen regions repetitives que es poden llegir malament fàcilment per la seqüenciació i el mapatge incorrecte d'Illumina, de manera que normalment s'eliminen del flux de treball bioinformàtic dels membres de M. tuberculosis només quan s'utilitza l'estratègia de mapatge a seqüència. La inferència d'esdeveniments de recombinació aplicada en aquest treball es basa en l'assemblatge de novo sense filtrar PE/PPE. Creiem que, implementant tres mètodes i algoritmes complementaris diferents a través de SplitsTree, el pipeline de Gubbins i el programari RDP4, les estratègies aplicades són robustes per processar i filtrar les regions reorganitzades causades per senyals d'error. Tanmateix, per tal d'excloure la interferència del gen PE/PPE en el programari Gubbins i RDP4 per identificar clústers de SNP, i per tant la identificació de les regions de recombinació proposades per afectar els gens narX i pks12, es va examinar el veïnatge d'aquests gens (Fig. suplementària 3-5). A M. bovis AF2122/97, el gen narX està separat per narK2 i Mb1764c, mentre que pks12 està envoltat per Mb2075c i Mb2073c (Figura suplementària 3-5). El mapa generat mitjançant el mapa de sinínia MAUVE del genoma complet proporciona informació sobre la conservació i el reordenament de la seqüència gènica, mostrant quatre blocs col·lineals i cap signe de translocació o inversió del genoma. A més, l'anàlisi de complementació amb la seqüència d'aminoàcids va demostrar l'homologia en tots els genomes complets, i no es va trobar PE/PPE a les regions adjacents de narX o pks12. Per a narX, un genoma (Mb0030) té una puntuació de sinonímia més baixa perquè el gen narX es va identificar com dos fragments (fragments 1891 i 1890). Per a pks12, a causa de les similituds, Mb0030 i Mb003 van mostrar puntuacions de sinlinearitat més baixes, mentre que pks12 es va identificar en dos i tres fragments, respectivament, que representaven diferents dominis de la proteïna (Figura suplementària 3-5). Tenint en compte aquesta informació, i que tant el programari Gubbins com RDP4 realitzen anàlisis, comproven l'alineació múltiple central del màxim de 500 bp a la finestra, i vam confirmar que el gen PE/PPE no interferirà amb el senyal de recombinació que afecta narX i pks12.
Tot i que els senyals de recombinació detectats en aquest conjunt de dades es poden considerar residuals, és cert que no es pot descartar la recombinació en M. bovis, per la qual cosa hauria de continuar sent objecte d'anàlisis posteriors, en què es seqüenciïn genomes complets de diferents escenaris epidemiològics fins a Important.
La comparació dels arbres filogenètics ML obtinguts abans i després de la correcció de la recombinació (Figura 2A, B) no va provocar canvis significatius en la relació filogenètica inferida, i les soques de M. bovis es van agrupar en el mateix grup.
Després de mapejar 42 lectures de M. bovis recentment seqüenciades amb el genoma de referència de M. bovis AF2122/97, es va obtenir un alineament de SNP que conté 1816 posicions polimòrfiques. La majoria dels SNP (87,1%) es troben a la regió codificant, i els gens afectats es caracteritzen segons les categories funcionals que es mostren a Bovilist (Figura 6A, B). Tenint en compte el nombre total de gens de cada categoria funcional, els gens de la categoria "metabolisme lipídic" van mostrar més SNP, seguits dels "processos de la paret cel·lular i cel·lulars" i "metabolisme i respiració intermedis", cosa que revela que es troben en l'evolució de M. bovis.
Anàlisi jeràrquica del conjunt de dades de M. bovis de Portugal (n = 42). El nombre total de SNP registrats i gens afectats per a cada categoria funcional (A). El nombre total de canvis sinònims i no sinònims registrats per categoria de funció (B).
A escala global, la relació dN/dS mitjana és superior a 1,5, cosa que indica que la pressió evolutiva global és eliminar l'estat ancestral i representa un escenari d'elecció de purificació positiu (diversificat o dirigit) i/o relaxat. En les categories de "virulència, desintoxicació, adaptació", "seqüències d'inserció i fags" i "proteïnes reguladores", més de dos terços dels SNP no són sinònims (Figura 6B).
En totes les categories, hi ha gens amb múltiples SNPs, cosa que resulta en una taxa de mutació mitjana (és a dir, la mitjana de SNP per gen) superior a 1 (Figura 6A). Pks12 (Mb2074c) amb 15 SNPs i fas (Mb2553c) amb 8 SNPs tenen valors de mutació més alts. Tots dos gens estan implicats en el metabolisme dels àcids grassos. El gen pks codifica la policètid sintasa (PKS), que és un enzim multifuncional implicat en la biosíntesi de lípids de la paret cel·lular micobacteriana74,75. Aquest gen codifica un polipèptid multifuncional que participa en la síntesi de micocètids74,76. El gen fas està implicat en la síntesi de l'àcid micòlic. Tots dos gens tenen un paper important en la biosíntesi de la paret cel·lular en contacte amb l'hoste.
Per tal d'estudiar més a fons l'evolució de Mycobacterium bovis, es van analitzar dos conjunts de gens específics. Treballs publicats anteriorment mitjançant mètodes de composició de seqüències i filogenètics van identificar gens que van ser adquirits pels avantpassats del MTBC a través de la HGT abans de la diversificació37,38. Aquests gens es mostren a la Taula suplementària 2. Es va analitzar la distribució d'SNP d'un total de 77 gens que poden estar relacionats amb la HGT i es van identificar 26 llocs polimòrfics, que en la majoria dels casos (78%) van resultar en canvis no sinònims (NS) (Taula suplementària 2). Treballs anteriors sobre el genoma del MTBC van demostrar que la putativa regió HGT presenta una proporció d'SNP NS més alta en comparació amb la resta del genoma. Si es pensa que aquestes regions de recombinació van ser adquirides pels avantpassats del MTBC i, per tant, sobrerepresenten polimorfismes antics, s'espera que la proporció de canvis sinònims sigui més alta, perquè s'espera que les substitucions NS s'eliminin per selecció negativa a causa dels canvis d'aminoàcids que poden canviar la funció de la proteïna. Per tant, els nostres resultats indiquen que les conseqüències funcionals poden derivar-se de la substitució de gens similars a HGT, la qual cosa reflecteix la seva importància per a una valuosa diversitat genètica adaptativa.
Paral·lelament a aquesta anàlisi, es van examinar a fons els gens que codifiquen els components del sistema 3R (reparació, replicació i recombinació de l'ADN) d'acord amb la llista publicada anteriorment per dos Vultos i els seus col·laboradors (2008)39. L'intercanvi de fragments d'ADN idèntics no es pot observar directament, tot i que pot ser un procés freqüent quan hi ha bacteris estretament relacionats, com en el cas d'aquest conjunt de dades; a més, aquest procés pot ser la clau dels mètodes de reparació de l'ADN72, de manera que juga un paper en la recombinació homòloga. Es van identificar un total de 26 posicions polimòrfiques distribuïdes per 54 gens (Taula suplementària 3). En aquest conjunt de gens, els canvis en la NS van representar aproximadament el 65% de les conseqüències, cosa que concorda amb informes anteriors sobre soques de Mycobacterium tuberculosis.
Data de publicació: 21 d'octubre de 2021