Děkujeme za návštěvu webu Nature. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu pro CSS. Pro co nejlepší uživatelský zážitek doporučujeme používat novější verzi prohlížeče (nebo vypnout režim kompatibility v prohlížeči Internet Explorer). Zároveň, abychom zajistili trvalou podporu, budeme zobrazovat weby bez stylů a JavaScriptu.
Sekvenování genomu oživilo oblast výzkumu infekčních onemocnění a odhalilo epidemiologii onemocnění, patogenezi, interakce hostitel-patogen a evoluční proces, který je kladen na patogeny. Komplex Mycobacterium tuberculosis (MTBC) považuje Mycobacterium bovis za jednoho ze svých adaptivních členů, kteří způsobují tuberkulózu (TB) u suchozemských savců, a je typickým modelem bakteriální evoluce. Stejně jako ostatní členové MTBC se i Mycobacterium bovis předpokládá jako striktně klonovaný, pomalu se vyvíjející patogen a zjevně u něj neexistují žádné známky rekombinace nebo horizontálního přenosu genů. V této práci aplikujeme komparativní genomiku na soubor dat celé genomové sekvence (WGS) složený ze 70 kusů skotu M. z různých rodokmenů (Evropa a Afrika), abychom získali poznatky o genetické diverzitě skotu M. Evoluční síla. K odhadu známek reorganizace se používají tři různé metody. Celosvětově byl identifikován malý počet rekombinačních událostí a dvěma nezávislými metodami s pevným podkladem potvrzen. Nicméně ve srovnání s mutacemi má rekombinace slabší vliv na diverzitu M. bovis (celková r/m = 0,037). Průměrný rozdíl r/m získaný v klonálním komplexu Mycobacterium bovis v našem datovém souboru je v souladu s obecnou koncepcí, že stupeň rekombinace se může mezi liniemi přiřazenými ke stejnému taxonomickému druhu značně lišit. Na základě této práce nelze rekombinaci u Mycobacterium bovis vyloučit, a proto by měla být předmětem dalšího úsilí v budoucím srovnávacím genomickém výzkumu, v němž je klíčové WGS velkých datových souborů z různých epidemiologických scénářů po celém světě. Následně byla provedena další analýza menšího datového souboru Mycobacterium bovis (n = 42) z prevalence TBC u více hostitelů a bylo identifikováno více než 1 800 lokusů, z nichž alespoň jeden kmen vykazoval jednonukleotidový polymorfismus (SNP). Většina (87,1 %) se nachází v kódující oblasti a globální poměr nesynonymních změn (dN/dS) synonymních změn přesahuje 1,5, což naznačuje, že pozitivní selekce je důležitou evoluční silou působící na M. bovis. Vyšší podíl SNP byl detekován v genech bohatých na funkční kategorie „metabolismus lipidů“, „buněčná stěna a buněčné procesy“ a „mezilehlý metabolismus a dýchání“, což odhaluje jejich potenciál v biologii a evoluci, která je pro Mycobacterium bovis důležitá. Bližší pohled na geny u předků MTBC, kteří jsou náchylní k horizontálnímu přenosu genů a jsou zahrnuti v systému 3R (oprava, replikace a rekombinace DNA), odhaluje globální průměrnou negativní hodnotu Taijimaova D neutrálního testu, což naznačuje minulé selektivní skenování. Nedávné úzké hrdlo po expanzi populace je stále hlavním evolučním faktorem, který brání povinnému patogenu Mycobacterium bovis v boji s hostitelem.
Komplex Mycobacterium tuberculosis (MTBC) je jedním z nejúspěšnějších taxonů bakteriálních patogenů a typickým případem bakteriální evoluce. Jeho členové vykazují překvapivě vysokou nukleotidovou identitu na genomové úrovni (> 99 %)1,2. Různé ekotypy MTBC mohou způsobovat tuberkulózu (TB), což je infekční granulomatózní onemocnění, u široké škály hostitelských druhů od mikrosavců až po člověka3,4,5. V současné době komplex zahrnuje lidi [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] a patogeny adaptované na zvířata (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, „Bacillus chimpanzee“ a „dassie“)5,6. M. canettii (také známý jako „Nodobacter glabrata“) Průměrná nukleotidová identita s výše uvedenými mykobakteriemi je 98 % a srovnávací genomické práce ukázaly, že M. canettii a zbytek MTBC se nedávno odchýlily od společného předka.7 Vzhledem k této koncepci někteří autoři nazývají M. canettii členem MTBC 8.
MTBC je systematicky popisován jako striktní klonální komplex a jeho populační struktura je jasně řízena sníženou diverzitou, úzkými hrdly, selektivním skenováním a genetickým driftem9,10. Za předpokladu, že komplexní striktní klonální evoluci, jako jsou chybějící polymorfismy, nelze obnovit rekombinací. Na základě tohoto předpokladu byly jako molekulární markery evoluce MTBC navrženy po sobě jdoucí události genomové delece diferenciální oblasti (RD) a TbD1 (oblast specifická pro Mtb deleci 1)2,5,11. Práce v oblasti srovnávací genomiky a sekvenování celého genomu (WGS) podporují rozdělení členů adaptovaných na člověka do devíti linií (Mycobacterium tuberculosis L1 až L4, L7 a L8; a Mycobacterium africanum L5, L6 a L9), linie L2 až L4 sdílejí deleci v oblasti TbD12,11,12,13. Kromě toho se předpokládá, že členové adaptovaní na zvířata sdílejí společného předka, který je definován delecemi specifickými pro daný klad v RD7, RD8, RD9 a RD102, 5 a 14.
Horizontální přenos genů (HGT) a rekombinační události jsou považovány za vzácné a vyskytují se u předků MTBC, spíše než k odlišné historii celého člena MTBC15,16,17. Dvě rané zprávy Hughese a spolupracovníků (2002) a Gutackera a spolupracovníků (2006) naznačují, že rekombinační události mohou pomoci utvářet polymorfismy, které označují specifické lokusy u kmenů M. tuberculosis18,19. Důvody pro zjevný nedostatek rekombinace u MTBC jsou: (1) mechanický proces a ztráta schopnosti HGT; (2) vzácnost událostí HGT; (3) neexistuje žádná šance na rekombinační události ve výklenku MTBC14,17. Nedávno některé studie sekvenování celého genomu (WGS) aplikované na kmen MTBC 20 a Mycobacterium bovis 21 poskytly důkazy o rekombinaci, jako první ukázaly, že kmeny MTBC si často vyměňují malé fragmenty DNA, ale kvůli omezené variabilitě nukleotidových sekvencí tyto události stále nejsou zaznamenány.
Mycobacterium bovis je nejčastěji získaným členem MTBC z hospodářských zvířat (zejména skotu), ačkoli jej lze izolovat i z volně žijících zvířat a zvířat v oplocených chovech4,22,23,24. M. bovis se vyvinul do pěti hlavních klonálních komplexů [evropský 1 (Eu1), evropský 2 (Eu2), evropský 3 (Eu3), africký 1 (Af1) a africký 2 (Af2)], a to v závislosti na spoligotypizačním profilu, specifických delecích a jednonukleotidových polymorfismech (SNP) 25, 26, 27, 28, 29 ve specifických genech. Tyto klonální komplexy demonstrují rozmanitou strukturu populace Mycobacterium bovis a její asociaci s geografickými oblastmi. Kromě toho nedávná práce WGS provedená Zimpelem a spolupracovníky (2020) navrhla fylogenezi založenou na SNP Mycobacterium bovis s více než 1 900 genomy, což naznačuje, že existují alespoň čtyři různé linie (pojmenované Lb1 až Lb1 až Lb4). Tyto linie nejsou zcela v souladu s dříve definovaným klonálním komplexem, ačkoli lze potvrdit i geografickou specificitu30. Tito autoři provedli diferenciální analýzu fylogeneze a molekulárního datování, ale nestudovali rekombinaci30.
Předchozí práce využívající různé molekulární techniky, jako je spoligotypizace, MIRU-VNTR (mycobacterium interspersed repeat unit-variable tandem repeat number - variabilní tandem repeat number) a nedávná SNP typizace odhalily určitou úroveň genetické diverzity mezi kmeny M. bovis 31, 32, 33, 34, 35. Diferenciace genetické variability se stala důležitým nástrojem ve studiu epidemiologie onemocnění, což je užitečné pro hlubší pochopení patogeneze, virulence a přenosu onemocnění. Vznik metody WGS poskytuje možnost odhalit evoluční hnací faktory dané genomem Mycobacterium bovis v procesu adaptace a perzistence na různé hostitele a epidemiologické scénáře.
V této práci používáme komparativní genomickou analýzu různých datových sad Mycoplasma bovis (n = 70), včetně izolátů z různých klonálních komplexů, abychom získali vhled do evolučního procesu Mycoplasma bovis, zejména k vyřešení fylogenetických vztahů a rekombinačních událostí. Jako doplněk k této analýze byl dále zkoumán subdatový soubor izolátů M. bovis (n = 42) získaných z dobře charakterizované oblasti tuberkulózy s více hostiteli v Portugalsku31,36, aby se odvodila neidentita. Rovnováha mezi relativním poměrem substitucí sense (dN) a synonymních (dS) nukleotidů, stejně jako evoluční přínos specifických genomů zmíněných v literatuře, jsou37,38 získány předky MTBC prostřednictvím HGT a kódují genové komponenty systému 3R (DNA repair, replication, and recombination)39. Geny získané pomocí HGT byly vybrány, protože mohou představovat starověké polymorfismy, takže se očekává, že mohou obsahovat vyšší podíl synonymních změn. Geny zahrnuté v systému 3R byly vybrány, protože předchozí práce na kmenech M. tuberculosis naznačily obecné negativní/purifikační selekce, které na tyto geny působí, a ty mohou hrát důležitou roli v evoluci 39. Dalším cílem této práce je odvodit existenci reorganizačních událostí. Z tohoto důvodu, vzhledem k tomu, že náš soubor dat z Portugalska obsahuje pouze genomy evropského klonového komplexu 2 a kmenů, které tento klonový komplex nemají, jsme se rozhodli zahrnout veřejně dostupná genomová data, abychom konečně získali reprezentativní údaje pro všechny klonové komplexy a zlepšili robustnost a šíři výsledků.
Ústředním bodem této práce je 42 nově sekvenovaných genomů Mycoplasma bovis z portugalské endemické scény tuberkulózy s více hostiteli (podrobnosti níže), které byly dříve charakterizovány z epidemiologického hlediska36. Vzhledem k tomu, že datová sada z Portugalska obsahuje pouze zástupce evropských 2 klonových komplexů a kmeny bez určených komplexů, byla přidána veřejně dostupná data sekvenování celého genomu, aby se rozšířila datová sada, která zahrnuje všechny zástupce klonových komplexů M. bovis. Proto byly v této práci použity tři zdroje dat sekvenování celého genomu: kompletní/návrh sestavení genomu, až 10 scaffoldů uložených v NCBI (Národní centrum pro biotechnologické informace) (n = 15 izolátů); uložený v SRA (soubor Illumina fastq archivu sekvenčních čtení) reprezentující komplexní diverzitu klonů M. bovis (n = 12 izolátů)30; a 42 nově sekvenovaných genomů z Portugalska. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) byl z vyhledávání NCBI vyloučen. Jako referenční genom, který má být zahrnut do datové sady, se obvykle používá M. bovis AF2122/97. Vzhledem k veřejné nedostupnosti celé genomové sekvence reprezentované klonovacím komplexem African 1 a malému počtu genomů z reprezentativních kmenů Af2 a Eu1 byla v těchto případech použita původní sekvenční data poskytnutá SRA. Práce Zimpela a jeho spolupracovníků (2020) pomohla identifikovat genom z výše uvedeného klonovacího komplexu a pomohla vybrat Mycobacterium bovis pro zahrnutí do datové sady. Pro Eu3 je popsán pouze jeden typ genomu (Branger et al., 2020), takže genom, který zahrnujeme, je samostatným zástupcem komplexu Eu3.
Tato datová sada zahrnuje celosvětově 70 druhů kmenů Mycobacterium bovis izolovaných z 8 hostitelských druhů, rozšířených ve 12 zemích v letech 1985 až 2016. 36 druhů je označeno jako Eu2, 7 druhů jako Eu1, 1 druh jako Eu3, 3 druhy jako Af1, 4 druhy jako Af2 a 19 druhů nelze připsat žádnému klonálnímu komplexu (podrobnosti níže). Podrobné informace (včetně přístupového čísla) o Mycobacterium bovis použitém v této studii jsou uvedeny v tabulce 1 a doplňkové tabulce 1.
Ústředním tématem této studie je 42 nově sekvenovaných celých genomů Mycobacterium bovis z portugalských ohnisek tuberkulózy zvířat, které jsou distribuovány více než 12 let, jelikož potenciální systémy onemocnění volně žijících živočichů a hospodářských zvířat byly pravidelně monitorovány 31,36 (doplňkový obrázek 1). Podle následných postupů byly tyto kmeny izolovány ze skotu (n = 14), jelena lesního (n = 16) a divočáka (n = 12) v letech 2003 až 2015: zvířata byla odebrána a manipulováno s nimi v souladu s doporučenými protokoly. Vzorky tkání jsou uvedeny v příručce OIE pro suchozemská zvířata a jsou inokulovány na pevné a tekuté médium s pyruvátem Stonebrink a Löwenstein-Jensen. Kultury se inkubují při 37 °C a růst se kontroluje jednou týdně po dobu nejméně 12 týdnů. Kolonie se skladují přímo v roztoku glycerolu při -80 °C. V selektivním médiu Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) byly původní archivované vzorky pasážovány in vitro jednou za účelem získání DNA programu WGS. Za tímto účelem byl zmrazený zásobní roztok kultury obohacen 5% pyruvátem sodným a 10% ADS (50 g albuminu, 20 g glukózy, 8,5 g chloridu sodného v 1 l vody) na médiu Middlebrook 7H9 při teplotě 37 °C (Retrain). Po 4 týdnech růstu bylo médium obnoveno a kultura byla pravidelně monitorována, dokud nebyl pozorován růst. Buňky byly sklizeny centrifugací, pelet byl resuspendován v 500 µl fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS), zahříván na 99 °C po dobu 30 minut, centrifugován a supernatant byl skladován při -20 °C do WGS. Všechny postupy se provádějí v zařízeních biologické bezpečnosti úrovně 3.
Genomová knihovna WGS s párovými konci je připravena s použitím unikátního indexu každého vzorku DNA a pro sekvenování je použita technologie Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 vzorků) a HiSeq (2 × 150 pb) (dva izoláty) (Eurofins Genomics, Německo). Podle pokynů výrobce použijte k sekvenování genomové DNA analyzátor Illumina Genome Analyzer s oboustranným modulem a k vytvoření knihovny použijte sadu Nextera XT DNA Library Prep Kit od společnosti Illumina.
S přihlédnutím k datům získaným ze SRA (n = 12) lze identifikaci klonového komplexu použít jako metadata odpovídající publikace 30, 41, 43. Při zvažování kompletního genomu, s výjimkou Mycobacterium bovis AF2122/97 a Mycobacterium bovis 3601, které jsou rozpoznávány jako členové klonálního komplexu Eu1 a Eu3 25, 29, je genom stejný jako kompletní genom Mycobacterium tuberculosis H37Rv (přístupové číslo NCBI NC_000962.3). Zarovnání genomu se provádí pomocí MAFFT (multiple alignment program of aminoacid or nucleotide sequence, verze 7.458) a parametru -addfragments48. Poté se hledá absence různých klonálních komplexů a/nebo přítomnost SNP znaků.
Nově sekvenovaný Mycobacterium bovis (n = 42) a původní čtení sestaveného konceptu genomu (n = 3) shodují komplex s referenčním genomem Mycobacterium tuberculosis H37Rv prostřednictvím vSNP pipeline a bylo provedeno vyhledávání delecí a/nebo SNP znaků různých klonů.
Shromážděte informace z nedostatku znaků a/nebo přítomnosti/nepřítomnosti SNP a profilů spoligotypizace pro přiřazení genomických dat odpovídajícímu klonálnímu komplexu. U čtyř návrhů sestav nelze profil spoligotypizace odvodit, proto jsou zahrnuty do skupiny „bez složitosti“.
Bioinformatický pracovní postup, který tato práce používá, začíná de novo sestavením a mapováním na referenční strategii s cílem prozkoumat rekombinační události a specifické genomové polymorfismy. Obrázek 1 poskytuje vývojový diagram následujících kroků. Pro analýzu rekombinace se používají všechny genomy ke zvýšení robustnosti inferencí a souvisejících indikátorů.
Abychom snížili chyby při generování konsenzuálních sekvencí genomu, nejprve jsme provedli de novo sestavení a poté jsme získali vícenásobné zarovnání jádra. Pipeline Unicycler je aktuálně k dispozici na adrese https://github.com/rrwick/Unicycler49 a používá se k provedení de novo sestavení 54 sekvenovaných genomů (42 nově sekvenovaných a 12 souborů fastq získaných ze SRA). Stručně řečeno, před sestavením od nuly byla provedena analýza kvality čtení ve FastQC verze 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) a Trimmomatic verze 0.36 (je použita možnost „cutting Adapters and other lighting-specific sequences from reads“ a „Cut bases from the end of the read, if lower than the threshold quality of 20“) (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic)50. Poté byl pro sestavení genomu použit SPAdes optimiser49 a pro optimalizaci po sestavení Pilon verze 1.1851. Aby se zabránilo nesprávnému sestavení, byl zvolen konzervativní režim přemostění a velikost k-meru byla vyhledána a vybrána mezi 20 % a 95 % délky čtení. Řiďte se pokyny SPAdes a zvažte velikost čtení, odstraňte kontigy menší než 300 bp a stanovte hraniční hodnotu 52 pro hloubku pokrytí 20 čtení. Při strategii de novo sestavení nebyly odstraněny genomové oblasti, jako jsou vysoce repetitivní paralogy prolin-glutamátu (PE) a prolin-prolin-glutamátu (PPE).
Kvalita de novo sestavení je hodnocena pomocí QUAST pipeline (http://quast.sourceforge.net/quast.html), který usnadňuje obnovu kontigu a mapování referenčního genomu M. bovis AF2122/97 (přístupové číslo NCBI LT708304.1) (parametry kvality viz doplňková tabulka 1).
Pomocí vSNP pipeline (https://github.com/USDA-VS/vSNP) je soubor FASTQ nově sekvenovaného M. bovis ze sekvenování Illumina porovnán s referenčním genomem M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)). V souladu s doporučeními osvědčených postupů sady nástrojů pro analýzu genomu (GATK) 53, 54, 55 se pro rekalibraci použijí standardní parametry filtrů nebo variantní hmotnostní skóre. Výsledky se filtrují s použitím nejnižšího hmotnostního skóre SAMtools 150 a AC = 2. Pro kontrolu naměřených hodnot a vyloučení kontaminace se používá také Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/). vSNP pipeline použitý k mapování na sekvenční strategie v naší práci zkoumá řadu definovaných SNP a cílů a také vylučuje scénáře smíšené infekce. Pokrytí genomu přečtenými sekvencemi je lepší než 99 % (doplňková tabulka 1).
Abyste se vyhnuli chybám v mapování a nesprávným SNP, odfiltrujte variantu v následujících případech: (1) je podpořena méně než 20 odečtemi, (2) je nalezena s frekvencí menší než 0,9, (3) je přítomna alespoň v jednom kmeni, ale alespoň v jiném kmeni jsou mezery. K vizuálnímu ověření SNP a pozic s problémy s mapováním nebo zarovnáním byl použit integrovaný prohlížeč genomiky (IGV) verze 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56. Vzhledem k tomu, že geny prolin-glutamátu (PE) a prolin-prolin glutamátu (PPE) jsou vysoce duplikované a jsou součástí multigenové rodiny, snadno je lze při sekvenování a mapování pomocí Illuminy špatně interpretovat, proto jsou upřednostňovány. Pracovní postup mykobakteriální bioinformatiky odstranil členy tuberkulózního komplexu při použití strategie mapování na sekvenci k potvrzení SNP. Proto jsme z analýzy odfiltrovali geny PE/PPE a indely.
Podle Bovilistu (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) jsou všechny SNP rozděleny do funkčních kategorií. K odvození důsledků SNP (synonymní nebo nesynonymní změny) se používá SnpEff pipeline (https://pcingola.github.io/SnpEff/). Byla vytvořena nová databáze genomu Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
Vícenásobné zarovnání jádra genomu bylo provedeno pomocí Parsnp v1.2, aktuálně dostupného na https://github.com/marbl/parsnp57, s použitím 69 kompletních genomů/návrhů sestav (s volbou -c) a jako reference byl použit M. bovis AF2122/97 (LT708304.1). Byly provedeny čtyři vícenásobné zarovnání jádra: pouze členové klonovacího komplexu Eu2 (n = 37), včetně všech členů evropského klonovacího komplexu (n = 44), včetně bodu spojení evropského a afrického klonovacího komplexu (n = 51) a zahrnující všechny Mycobacterium bovis v této studii (n = 70).
Základní zarovnání generované programem Parsnp se používá k odvození fylogenetického stromu s maximální věrohodností (ML) pomocí programu CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 s využitím RAxML a k provedení 1000 řízených replikací.
Pro paralelní kontrolu přítomnosti rekombinačních událostí se používají tři různé algoritmy a bioinformatické nástroje: software SplitsTree4, pipeline Gubbins (nestranná lineage prostřednictvím rekombinace v nukleotidových sekvencích) a software RDP4 (program pro detekci rekombinace, verze beta 4.101).
Metoda split dekompozice implementovaná ve SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 je použita k výpočtu bezkořenové fylogenetické sítě s využitím Phi testu pro statistické ověření a prahová hodnota významnosti je p = 0,05. Jako vstup je použita analýza vícenásobného zarovnání jádra Parsnp a split dekompozice je realizována jako síťový standard.
Gubbins pipeline v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) běží s výchozími parametry jako další způsob, jak vyhodnotit dopad rekombinace na Mycobacterium bovis. Algoritmus implementovaný v pipeline rekonstruuje relevantní klonovou linii. Kompletní sestava genomu/návrhu naší datové sady a referenčního genomu (bovinní bovid AF2122/97, LT708304.1) jsou vzájemně porovnány; a skenuje se pozice SNP na každé větvi stromu za účelem detekce shluku SNP představujícího rekombinační událost. Nula větve se předpokládá, že nedošlo k žádné rekombinační události, což znamená, že SNP, které se na větvi vyskytují, by měly být rovnoměrně rozloženy. Jako vstupní soubory se používají základní vícenásobné zarovnání z Parsnp a nejlépe skórovaný ML strom z RAxML.
Nakonec, aby se potvrdila reorganizační událost navržená Gubbinsovým kanálem, bylo šest algoritmů implementovaných v RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 a SiScan66) aplikováno na vícenásobné zarovnání jádra Parsnp za výchozího nastavení. Zjistili jsme, že alespoň tři z algoritmů implementovaných v RDP4 musí konzistentně prokazovat důležitý signál pro ověření každé rekombinační události.
Vzhledem k tomu, že software Gubbins i RDP hledají rekombinační signály kontrolou vícenásobných zarovnání v okně až 500 bp a potvrzují, že zahrnutí genů PE/PPE během de novo sestavení nebude interferovat s nalezenými rekombinačními signály, provádí se další analýza pomocí kontroly homolinearity (kontrola okolí genu identifikujícího rekombinační událost). Synlineární mapa s použitím kompletního genomu byla vytvořena pomocí MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) k vyloučení lokálních translokací nebo inverzí genomu. Kromě toho byl celý genom použit k provedení homolinearity aminokyselinové sekvence prostřednictvím webového serveru SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Podrobnější analýza souboru genomových dat získaných z portugalského systému multihostitelské tuberkulózy má za cíl ověřit polymorfismus genů zmíněných v literatuře. Těmito geny jsou 37, 38 a gen kódující 3R, které předkové MTBC získali prostřednictvím komponent systému HGT (oprava, replikace a rekombinace DNA) 39. Pro výpočet genové diverzity a nukleotidové diverzity (π) a vstupního parametru Tajimaova D neutrálního testu použijte ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) a DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/).
Byl získán fylogenetický strom maximální věrohodnosti (ML) založený na 69 izolátech Mycoplasma bovis a referenčních genomech (obrázek 2A). Ve srovnání se stromy založenými na jednom genu nebo na více lokusech tato strategie umožňuje generování silnějších stromů, které nezachycují variabilitu celého genomu, a proto vykazují nižší schopnost rozlišovat mezi druhy 68,69. Topologická struktura stromu ML je obvykle v souladu s komplexní klasifikací klonů. Genom Eu2 je seskupen ve větvi a genom Af1 je také seskupen dohromady (obrázek 2A). Výsledek je také v souladu se známým evolučním vztahem Mycobacterium bovis, tj. existuje velký rozdíl mezi členem Eu1 a skupinou sestávající ze všech ostatních klonálních komplexů a genomů, ale klonální komplex 30 není specifikován. Malou nekonzistenci mezi klonálním komplexem a vztahem pozorovaným na fylogenetickém stromu lze vysvětlit skutečností, že klonální komplex je popsán na základě specifických genomových oblastí, zatímco fylogenetický strom je založen na vícenásobném zarovnání jádrových genomů reprezentujících celý genom.
Fylogenetický strom s maximální pravděpodobností (GTR) je konstruován na základě zarovnání jádra genomu Mycobacterium bovis před (A) a po (B) odstranění rekombinačního místa. Barvy větví představují klonový komplex Mycobacterium bovis: Evropa 1 je fialová, Evropa 2 je červená, Evropa 3 je modrá, Afrika 1 je oranžová a Afrika 2 je zelená. Strom je zakořeněný a nakreslený v měřítku a délka větve je měřena jako náhrada pro každé místo.
Komplex Mycobacterium tuberculosis je popisován jako klonálně vyvinutý a většina důkazů nashromážděných v průběhu let podporuje myšlenku, že probíhající HGT a rekombinační události se nevyskytnou na detekovatelné úrovni MTBC15,17,18.
Předchozí práce ukázaly, že mezi kmeny MTBC může docházet k omezené rekombinaci20,21, zatímco jiné se nepodařilo identifikovat měřitelné rekombinační události70,71. Znovu prodiskutujte tuto problematiku se zaměřením na Mycobacterium bovis, což se liší od předchozí práce, která zohledňovala pouze Mycobacterium tuberculosis70,71; nebo zohledněte MTBC jako celek, téměř bez M. bovis reprezentujícího20; nebo zohledněte pouze restriktivní frakce skotu. Soubor dat o mykobakteriích, v této práci, obsahuje celkem 70 kmenů, reprezentujících všechny klonální komplexy, které se používají k screeningu rekombinace. Soubor dat je škálován podle čtyř kumulativních úrovní: (1) členové Eu2, (2) všichni členové evropského klonového komplexu (tj. Evropa), (3) evropský a africký klonový komplex (Eu + Af) a (4) celé datové sbírky (včetně genomů, které nejsou zahrnuty v žádných již popsaných klonovacích komplexech).
Pro další studium této hypotézy byla provedena síť s rozděleným dekompozičním systémem, která měla posoudit absenci rekombinačních událostí mezi genomy, protože tato metoda dokáže vizualizovat vztah mezi jedinci a zobrazit protichůdné fylogenetické signály. Všechny čtyři datové sady v analýze potvrdily existenci smyček v síti (tj. oblastí, které nesbíhají do jednoho stromu), ale Phi test nemá statistickou podporu (Eu2, p = 0,0956; Evropa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; celá datová sada p = 0,2451), což poskytuje slabé důkazy o existenci reorganizačních událostí (obrázek 3A-D).
V Evropě 2 genomy (n = 37) (A), evropské genomy (n = 44) (B), evropské a africké genomy (n = 51) (C) a celá datová sada (n = 70) (D).
Po této analýze a s ohledem na cyklická pozorování ve všech sítích byl použit rekonstrukční algoritmus implementovaný v Gubbinsově pipeline k rekonstrukci klonální linie a k doplnění odhadu vlivu rekombinace na genom M. bovis. Odhadněte kumulativní počet rekombinačních událostí, z nichž většina proběhla v terminálních větvích (tj. v jednom genomu) (tabulka 2). Tyto indikátory ukazují konzistenci celého datového souboru a naznačují, že frekvence rekombinačních událostí je 200 až 300krát vyšší než frekvence mutací. Parametr rho/theta představující relativní rychlosti rekombinace a bodových mutací na větvi se zdá být mezi 0,0037 a 0,0056 (tabulka 3). Nedávno publikovaná práce kmene 38 M. bovis prokázala vyšší hodnotu rho/theta (rho/theta = 0,1) než ta, která byla získána v tomto souboru dat, ale práce Pataného a kolegů použila sestavení založené na referencích k odvození parametrů rekombinace. Procedurální detail, způsobený postupem sestavení, byl spojován s množstvím předpokládaných rekombinačních událostí v terminální větvi.
Parametr r/m dále představuje poměr diverzity rekombinace a zavedení mutací a jeho průměrná hodnota se pohybuje mezi 0,025 a 0,037, což naznačuje, že ve srovnání s mutacemi má rekombinace nižší celkový dopad na genetickou diverzitu M. bovis (tabulka 3). Pro rozsáhlé srovnání byla použita podobná metoda k odhadu parametru r/m pro datovou sadu MTBC složenou z 23 genomů, která vykazuje průměrnou hodnotu 0,48620, zatímco pro datovou sadu 38 genomů M. bovis od Pataného a kolegů se prokázala průměrná hodnota 0,98. V první studii byly do práce M. bovis zahrnuty pouze dva z 23 genomů (M. bovis BCG a referenční kmen), takže získaná hodnota může být zkreslená v důsledku nadměrné exprese genomu M. tuberculosis. Ve druhé zprávě byly analyzované populace Mycobacterium bovis získány převážně ze Spojených států a od hostitelských hospodářských zvířat. Naproti tomu v našem datovém souboru je zastoupeno více geografických lokalit a hostitelských druhů a jsou použity také genomy seskupené do různých klonálních komplexů s různými genetickými charakteristikami populace, čímž se dosahuje hlubších a širších znalostí o populaci. Průměrná hodnota rozdílu r/m získaná s naším datovým souborem je v souladu s konceptem, že stupeň rekombinace se mezi liniemi přiřazenými ke stejnému taxonomickému druhu značně liší, takže tyto výsledky naznačují, že klonový komplex M. bovis může vykazovat rozdíly v rekombinaci. Dopad je také takový, jak naznačují Didelot a Maiden72. Nicméně významné rozšíření tohoto datového souboru zahrnutím většího počtu genomů M. bovis umožní další objasnění tohoto bodu. Parametry r/m i rho/theta vykazují variabilitu mezi větvemi a tento výsledek je v souladu se zprávami o jiných bakteriálních druzích72,73.
Konečně, aby se potvrdily reorganizační události identifikované Gubbinsovým postupem, bylo v softwaru RDP4 použito šest různých algoritmů k nezávislému testování různých multi-comparisonů v jádru. Celosvětově byla RDP4 potvrzena méně než polovina událostí identifikovaných Gubbinsovým postupem (tabulky 4 a 5). Z celého datového souboru byly potvrzeny tři rekombinační události, dvě zahrnující interní uzly a další zahrnující jeden genom v terminální větvi, pro kterou nebylo možné přiřadit klonální komplexy (tabulky 4 a 5). Identifikace událostí v terminálních větvích může naznačovat, že rekombinace u současných kmenů M. bovis stále probíhá nebo že je výsledek špatně umístěn70. V této hypotetické rekombinační oblasti má přibližně 20 % pozic nedefinované nukleotidy (N), což ovlivňuje rekombinační signál (doplňkový obrázek 2). Tato oblast navíc ovlivňuje gen rrs, kódující 16S ribozomální RNA, u které se očekává, že je vysoce konzervovaná, takže tento předpokládaný rekombinační signál může být výsledkem chyb v sekvenování nebo špatného zarovnání. Poté bylo provedeno celé zarovnání genomu mezi Mb0003 a Mycobacterium bovis AF2122/97 a byla potvrzena existence nedefinovaných nukleotidů a SNP, takže možné problémy související s nesprávným zarovnáním nebyly způsobeny biologickou informací implementovanou v této práci. Objevily se po seznámení se s programem.
V rekombinačních oblastech vnitřních uzlů nebyly nalezeny žádné mezery ani nedefinované nukleotidy (obrázky 4 a 5). Pokud jde o tyto události, jedna obsahuje pouze genom Eu2 a ovlivňuje gen pks12, který kóduje možnou polyketid syntázu; zatímco druhá je registrována v genomu Eu1 a ovlivňuje gen narX, který kóduje možnou nitrát reduktázu (tabulka 4). Obecně analýza rekombinace ukazuje, že existuje omezený počet rekombinačních fragmentů se statistickou podporou a odvozené indikátory naznačují, že rekombinace má nízký dopad na linii M. bovis. Očekává se, že rekombinační signál bude nízký, ale je důležité odlišit skutečný evoluční signál od šumu pozadí, což je náročný úkol. Aby se snížil šumový signál zavedený problémy se sestavováním na základě referencí a nesouladem 70, 71, všechny ostatní genomy kromě kompletního byly sestaveny od nuly a kvalita sestavení byla kontrolována a zajištěna analýzou QUAST pipeline (doplňková tabulka 1). Dále byla provedena řada doplňkových analýz, aby se zajistila robustnost a přesnost celkového průzkumu. Proto byla kvalita sekvenování genů narX a pks12 vyhodnocena pomocí mapování čtení proti Mycobacterium bovis AF2122/97. Doporučená pozice SNP v rekombinační oblasti byla potvrzena aplikací kritérií uvedených v metodické části (alespoň 20 čtení a frekvence změn 0,9). Polymorfismus genu narX byl plně potvrzen ve dvou genomech (Mb1792361 a Mb7240415; 2,3 %) a v genomech genomu pks12: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 a Mb12. U genomu Mb2043 však šest z osmi pozic nesplňuje kritérium hloubky čtení, protože SNP je podpořen maximálně 17 čteními, což je pod stanovenou mezní hodnotou 20. Proto lze potvrdit rekombinaci šesti genomů (8,6 %) v tomto místě genomu (obrázky 4 a 5).
Detailní vizualizace zarovnání rekombinační oblasti datové sady Mycobacterium bovis ovlivňuje gen narX, který kóduje možnou nitrátreduktázu. V rekombinační oblasti vnitřních uzlů nebyly nalezeny žádné mezery ani nedefinované nukleotidy. Tato konkrétní událost je registrována v genomu Eu1. Kvalita sekvenování genu narX byla vyhodnocena vynesením čtení Mycobacterium bovis AF2122/97. Doporučené umístění SNP v rekombinační oblasti potvrďte použitím kritérií uvedených v metodické části (alespoň 20 čtení a frekvence změn 0,9). Polymorfismus genu narX byl plně potvrzen v genomech Mb1792361 a Mb7240415 (2,3 %).
Detailní vizualizace zarovnání rekombinační oblasti datové sady Mycoplasma bovis ovlivňující gen pks12. V rekombinační oblasti vnitřních uzlů nebyly nalezeny žádné mezery ani nedefinované nukleotidy. Pokud jde o událost ovlivňující gen pks12 kódující možnou polyketid syntázu, obsahuje pouze genom Eu2. Kvalita sekvenování pks12 byla vyhodnocena mapováním čtení genu Mycobacterium bovis AF2122/97. Doporučené umístění SNP v rekombinační oblasti potvrďte použitím kritérií uvedených v metodické části (alespoň 20 čtení a frekvence změn 0,9). Polymorfismy genomů Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 a Mb1960 byly plně potvrzeny.
Geny PE a PPE mají repetitivní oblasti, které lze snadno chybně přečíst sekvenováním a mapováním pomocí Illumina, takže jsou obvykle z bioinformatického pracovního postupu členů M. tuberculosis odstraněny pouze při použití strategie mapování na sekvenci. Inference rekombinačních událostí použitá v této práci je založena na de novo sestavování bez filtrování PE/PPE. Domníváme se, že implementací tří různých doplňkových metod a algoritmů prostřednictvím softwaru SplitsTree, Gubbins pipeline a RDP4 jsou použité strategie robustní pro zpracování a filtrování reorganizovaných oblastí způsobených chybovými signály. Aby se však vyloučila interference genu PE/PPE se softwarem Gubbins a RDP4 pro identifikaci SNP shluků, a tím i pro identifikaci rekombinačních oblastí, u kterých se předpokládá, že ovlivňují geny narX a pks12, bylo zkoumáno okolí těchto genů (doplňkový obrázek 3–5). U M. bovis AF2122/97 je gen narX oddělen geny narK2 a Mb1764c, zatímco pks12 je obklopen geny Mb2075c a Mb2073c (doplňkový obrázek 3-5). Mapa vytvořená pomocí synlineární mapy MAUVE kompletního genomu poskytuje informace o konzervaci a přeskupení genové sekvence a ukazuje čtyři kolineární bloky a žádné známky translokace nebo inverze genomu. Analýza komplementace s aminokyselinovou sekvencí navíc prokázala homologii ve všech kompletních genomech a v sousedních oblastech narX ani pks12 nebyl nalezen žádný PE/PPE. U narX má jeden genom (Mb0030) nižší skóre synonymie, protože gen narX byl identifikován jako dva fragmenty (fragmenty 1891 a 1890). U pks12 vykazovaly Mb0030 a Mb003 v důsledku podobností nižší skóre synlinearity, zatímco pks12 byl identifikován ve dvou, respektive třech fragmentech, které představují různé domény proteinu (doplňkový obrázek 3-5). S ohledem na tyto informace a s ohledem na provedení analýzy softwarem Gubbins a RDP4 a kontrolu vícenásobného zarovnání jádra maximálních 500 bp v daném okně jsme potvrdili, že gen PE/PPE nebude interferovat s rekombinačním signálem, který ovlivňuje narX a pks12.
Ačkoli rekombinační signály detekované v tomto souboru dat lze považovat za reziduální, je pravda, že rekombinaci u M. bovis nelze vyloučit, a proto by měla být i nadále předmětem další analýzy, v níž jsou celé genomy z různých epidemiologických scénářů sekvenovány do důležitého stavu.
Porovnání fylogenetických stromů ML získaných před a po korekci rekombinace (obrázek 2A, B) nevedlo k významným změnám v odvozeném fylogenetickém vztahu a kmeny M. bovis byly seskupeny do stejné skupiny.
Po zmapování 42 nově sekvenovaných čtení M. bovis s referenčním genomem M. bovis AF2122/97 bylo získáno zarovnání SNP obsahující 1816 polymorfních pozic. Většina SNP (87,1 %) se nachází v kódující oblasti a postižené geny jsou charakterizovány podle funkčních kategorií uvedených v Bovilistu (obrázek 6A, B). S ohledem na celkový počet genů v každé funkční kategorii vykazovaly geny v kategorii „metabolismus lipidů“ více SNP, následované geny „buněčná stěna a buněčné procesy“ a „mezilehlý metabolismus a dýchání“, což ukazuje, že se nacházejí v evoluci M. bovis.
Hierarchická analýza datové sady M. bovis z Portugalska (n = 42). Celkový počet registrovaných SNP a postižených genů pro každou funkční kategorii (A). Celkový počet synonymních a nesynonymních změn registrovaných podle funkční kategorie (B).
V globálním měřítku je průměrný poměr dN/dS lepší než 1,5, což naznačuje, že globální evoluční tlak směřuje k zbavení se ancestrálního stavu a představuje pozitivní (diverzifikovaný nebo řízený) a/nebo uvolněný scénář výběru purifikace. V kategoriích „virulence, detoxikace, adaptace“, „inzerční sekvence a fágy“ a „regulační proteiny“ jsou více než dvě třetiny SNP nesynonymní (obrázek 6B).
Ve všech kategoriích existují geny s více SNP, což má za následek průměrnou míru mutací (tj. průměrný SNP na gen) větší než 1 (obrázek 6A). Pks12 (Mb2074c) s 15 SNP a fas (Mb2553c) s 8 SNP mají vyšší hodnoty mutací. Oba tyto geny se podílejí na metabolismu mastných kyselin. Gen pks kóduje polyketid syntázu (PKS), což je multifunkční enzym zapojený do biosyntézy lipidů buněčné stěny mykobakterií74,75. Tento gen kóduje multifunkční polypeptid, který se podílí na syntéze mykoketidů74,76. Gen fas se podílí na syntéze kyseliny mykolové. Oba tyto geny hrají důležitou roli v biosyntéze buněčné stěny v kontaktu s hostitelem.
Pro další studium evoluce Mycobacterium bovis byly analyzovány dvě sady specifických genů. Dříve publikované práce využívající metody složení sekvencí a fylogenetických metod identifikovaly geny, které předkové MTBC získali prostřednictvím HGT před diverzifikací37,38. Tyto geny jsou uvedeny v doplňkové tabulce 2. Byla analyzována distribuce SNP celkem 77 genů, které mohou souviset s HGT, a bylo identifikováno 26 polymorfních míst, která ve většině případů (78 %) vedla k nesynonymním (NS) změnám (doplňková tabulka 2). Předchozí práce na genomu MTBC ukázaly, že předpokládaná oblast HGT vykazuje vyšší poměr NS SNP ve srovnání se zbytkem genomu. Pokud se domníváme, že tyto rekombinační oblasti byly získány předky MTBC, a proto nadměrně reprezentují starověké polymorfismy, pak se očekává, že podíl synonymních změn bude vyšší, protože se očekává, že NS substituce budou eliminovány negativní selekcí kvůli změnám aminokyselin, které mohou změnit funkci proteinu. Naše výsledky tedy naznačují, že funkční důsledky mohou pramenit z nahrazení genů podobných HGT, což odráží jejich význam pro cennou adaptivní genetickou diverzitu.
Souběžně s touto analýzou byly geny kódující komponenty systému 3R (oprava, replikace a rekombinace DNA) důkladně zkoumány v souladu se seznamem dříve publikovaným dos Vultosem a spolupracovníky (2008)39. Výměnu identických fragmentů DNA nelze přímo pozorovat, i když se může jednat o častý proces, pokud se jedná o blízce příbuzné bakterie, jako v případě této datové sady; navíc tento proces může být klíčem k metodám opravy DNA72, takže hraje roli v homologní rekombinaci. Celkem bylo identifikováno 26 polymorfních pozic rozdělených podle 54 genů (doplňková tabulka 3). V této sadě genů představovaly změny NS přibližně 65 % důsledků, což je v souladu s předchozími zprávami o kmenech Mycobacterium tuberculosis.
Čas zveřejnění: 21. října 2021