Tak for dit besøg på Nature. Den browserversion, du bruger, har begrænset understøttelse af CSS. For at få den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en nyere version af browseren (eller slår kompatibilitetstilstanden fra i Internet Explorer). Samtidig vil vi vise websteder uden typografier og JavaScript for at sikre fortsat understøttelse.
Genomsekventering har revitaliseret forskningen i infektionssygdomme og afsløret sygdomsepidemiologi, patogenese, vært-patogen-interaktioner og den evolutionære proces, der pålægges patogener. Mycobacterium tuberculosis-komplekset (MTBC) betragter Mycobacterium bovis som et af sine dyrs adaptive medlemmer, der forårsager tuberkulose (TB) hos landpattedyr, og er en typisk model for bakteriel evolution. Ligesom andre MTBC-medlemmer antages Mycobacterium bovis at være et strengt klonet, langsomt udviklende patogen, og der er tydeligvis ingen tegn på rekombination eller horisontal genoverførsel. I dette arbejde anvender vi sammenlignende genomik på et helgenomsekvensdatasæt (WGS) bestående af 70 M. kvæg fra forskellige stamtavler (Europa og Afrika) for at få indsigt i den genetiske diversitet af M. kvægs evolutionære kraft. Tre forskellige metoder bruges til at estimere tegnene på reorganisering. Globalt er et lille antal rekombinationshændelser blevet identificeret og bekræftet af to uafhængige metoder med solid støtte. Ikke desto mindre har rekombination sammenlignet med mutationer en svagere effekt på diversiteten af M. bovis (samlet r/m = 0,037). Forskellen i r/m-gennemsnit opnået i det klonale kompleks af Mycobacterium bovis i vores datasæt er i overensstemmelse med den generelle opfattelse af, at graden af rekombination kan variere meget mellem de linjer, der er tildelt den samme taksonomiske art. Baseret på dette arbejde kan rekombination i Mycobacterium bovis ikke udelukkes, så det bør være genstand for yderligere indsats i fremtidig sammenlignende genomforskning, hvor WGS af store datasæt fra forskellige epidemiologiske scenarier rundt om i verden er afgørende. En yderligere analyse blev derefter udført på det mindre Mycobacterium bovis-datasæt (n = 42) fra multi-vært TB-prævalensen, og mere end 1.800 loci blev identificeret, hvoraf mindst én stamme viste en enkelt nukleotidpolymorfi (SNP). De fleste (87,1%) er placeret i den kodende region, og det globale forhold mellem ikke-synonyme ændringer (dN/dS) af synonyme ændringer overstiger 1,5, hvilket indikerer, at positiv selektion er en vigtig evolutionær kraft, der udøves på M. bovis. En højere andel af SNP'er blev detekteret i gener, der er rige på funktionelle kategorier som "lipidmetabolisme", "cellevæg og cellulære processer" og "mellemliggende metabolisme og respiration", hvilket afslører deres potentiale i biologien og evolutionen af Mycobacterium bovis' betydning. Et nærmere kig på generne i MTBC-forfædrene, der er tilbøjelige til horisontal genoverførsel og inkluderet i 3R-systemet (DNA-reparation, replikation og rekombination), afslører den globale gennemsnitlige negative værdi af Taijimas D-neutraltest, hvilket indikerer tidligere selektiv scanning. Den nylige flaskehals efter populationsudvidelse er stadig den vigtigste evolutionære drivkraft for den obligatoriske patogen Mycobacterium bovis til at bekæmpe værten.
Mycobacterium tuberculosis-komplekset (MTBC) er en af de mest succesfulde taxa af bakterielle patogener og et typisk tilfælde af bakteriel evolution. Dens medlemmer udviser overraskende høj nukleotididentitet på genomisk niveau (> 99%)1,2. Forskellige MTBC-økotyper kan forårsage tuberkulose (TB), som er en infektiøs granulomatøs sygdom, hos en bred vifte af værtsarter fra mikropattedyr til mennesker3,4,5. I øjeblikket omfatter komplekset mennesker [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] og dyretilpassede patogener (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" og "dassie")5,6. M. canettii (også kendt som "Nodobacter glabrata") Den gennemsnitlige nukleotididentitet med de førnævnte mykobakterier er 98%, og sammenlignende genomisk arbejde har vist, at M. canettii og resten af MTBC for nylig har afveget fra den fælles forfader.7 I betragtning af dette koncept kalder nogle forfattere M. canettii for medlem af MTBC 8.
MTBC beskrives systematisk som et strengt klonalt kompleks, og dets populationsstruktur er tydeligt styret af reduceret diversitet, flaskehalse, selektiv scanning og genetisk drift9,10. Hvis man antager, at kompleks streng klonal evolution, såsom manglende polymorfier, ikke kan gendannes ved rekombination. Baseret på denne præmis er de på hinanden følgende begivenheder med genomisk deletion af den differentielle region (RD) og TbD1 (Mtb-specifik deletion 1-region) blevet foreslået som molekylære markører for MTBC-evolution2,5,11. Sammenlignende genomik og helgenomsekventeringsarbejde (WGS) understøtter opdelingen af mennesketilpassede medlemmer i ni slægter (Mycobacterium tuberculosis L1 til L4, L7 og L8; og Mycobacterium africanum L5, L6 og L9), hvor slægterne L2 til L4 delte deletion af TbD1-regionen2,11,12,13. Derudover foreslås det, at dyretilpassede medlemmer deler en fælles forfader, som er defineret af kladespecifikke deletioner i RD7, RD8, RD9 og RD102, 5 og 14.
Horisontal genoverførsel (HGT) og rekombinationshændelser betragtes som sjældne og forekommer i MTBC's forfædre snarere end i hele MTBC-medlemmets forskellige historie15,16,17. To tidlige rapporter fra Hughes og samarbejdspartnere (2002) og Gutacker og samarbejdspartnere (2006) antydede, at rekombinationshændelser kan være med til at forme polymorfier, der markerer specifikke loci i M. tuberculosis-stammer18,19. Årsagerne til den åbenlyse mangel på rekombination i MTBC er: (1) den mekaniske proces og tabet af HGT's evne; (2) sjældenheden af HGT-hændelser; (3) der er ingen chance for rekombinationshændelser i MTBC-nichen14,17. For nylig har nogle helgenomsekventeringsstudier (WGS) anvendt på MTBC-stamme 20 og Mycobacterium bovis 21 givet bevis for rekombination, den første til at vise, at MTBC-stammer ofte udveksler små DNA-fragmenter, men på grund af begrænset variation i nukleotidsekvensen er disse hændelser stadig ikke bemærket.
Mycobacterium bovis er det hyppigst fundne MTBC-medlem fra husdyr (primært kvæg), selvom det også kan isoleres fra fritgående og indhegnede vilde dyr4,22,23,24. M. bovis udviklede sig til fem store klonale komplekser [Europæisk 1 (Eu1), Europæisk 2 (Eu2), Europæisk 3 (Eu3), Afrikansk 1 (Af1) og Afrika 2 (Af2)], i henhold til spoligotypningsprofilen, specifikke deletioner og enkeltnukleotidpolymorfier (SNP'er)25, 26, 27, 28, 29 i specifikke gener. Disse klonale komplekser demonstrerer den forskelligartede struktur af Mycobacterium bovis-populationen og dens forbindelse med geografiske regioner. Derudover designede det nylige WGS-arbejde udført af Zimpel og samarbejdspartnere (2020) en fylogeni baseret på SNP'en fra Mycobacterium bovis med mere end 1.900 genomer, hvilket indikerer, at der er mindst fire forskellige linjer (navngivet Lb1 til Lb1 til Lb4). De er ikke fuldstændigt konsistente med det tidligere definerede klonale kompleks, selvom geografisk specificitet også kan bekræftes30. Disse forfattere udførte differentiel analyse af fylogeni og molekylær datering, men undersøgte ikke rekombination30.
Tidligere arbejde med forskellige molekylære teknikker, såsom spoligotypning, MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number) og nyere SNP-typning har afsløret et vist niveau af genetisk diversitet blandt M. bovis-stammer 31, 32, 33, 34, 35. Differentieringen af genetisk variation er blevet et vigtigt værktøj i studiet af sygdomsepidemiologi, hvilket er nyttigt for en dybdegående forståelse af patogenese, virulens og sygdomsoverførsel. Fremkomsten af WGS-metoden giver mulighed for at afsløre de evolutionære drivende faktorer, der pålægges af Mycobacterium bovis-genomet i processen med tilpasning og persistens til forskellige værter og epidemiologiske scenarier.
I dette arbejde bruger vi sammenlignende genomisk analyse på forskellige Mycoplasma bovis-datasæt (n = 70), herunder isolater fra forskellige klonale komplekser, for at få indsigt i den evolutionære proces af Mycoplasma bovis, især for at løse fylogenetiske relationer og rekombinationshændelser. Som et supplement til denne analyse blev et deldatasæt af M. bovis-isolater (n = 42) opnået fra et velkarakteriseret område med flere værter i Portugal 31,36 yderligere undersøgt for at udlede manglende identitet. Balancen mellem det relative forhold mellem sense (dN) og synonyme (dS) nukleotidsubstitutioner, samt det evolutionære bidrag fra specifikke genomer nævnt i litteraturen, er 37,38 opnået af MTBC-forfædre gennem HGT og koder for 3R (DNA-reparation, replikation og rekombination) systemgenkomponenter 39. Vælg gener opnået gennem HGT, fordi de kan repræsentere gamle polymorfier, så det forventes, at de kan indeholde en højere andel af synonyme ændringer. Generne inkluderet i 3R-systemet blev udvalgt, fordi tidligere arbejde med M. tuberculosis-stammer indikerede generelle negative/oprensningsselektioner, der virker på disse gener, og de kan spille en vigtig rolle i evolutionen 39. Et andet mål med dette arbejde er at udlede eksistensen af reorganiseringshændelser. Af denne grund, i betragtning af at vores datasæt fra Portugal kun indeholder genomerne af europæisk klonkompleks 2 og de stammer, der ikke har tildelt klonkomplekset, besluttede vi at inkludere offentligt tilgængelige genomdata for endelig at opnå en repræsentativ for alle klonkomplekser og forbedre robustheden og bredden af resultaterne.
42 nyligt sekventerede Mycoplasma bovis-genomer fra den portugisiske endemiske multi-vært tuberkulose-scene (detaljer nedenfor), tidligere karakteriseret fra et epidemiologisk perspektiv36, er centrum for dette arbejde. I betragtning af at datasættet fra Portugal kun indeholder repræsentanter for de europæiske 2 klonkomplekser og stammer uden udpegede komplekser, er offentligt tilgængelige helgenomsekventeringsdata blevet tilføjet for at udvide datasættet, der inkluderer alle repræsentanter for M. bovis-klonkomplekserne. Derfor blev tre helgenomsekventeringsdatakilder anvendt i dette arbejde: komplet/kladde-genomsamling, op til 10 scaffolds gemt i NCBI (National Center for Biotechnology Information) (n = 15 isolater); gemt i SRA (Illumina fastq-filen fra sekvenslæsningsarkivet) repræsenterer den komplekse diversitet af M. bovis-kloner (n = 12 isolater)30; og 42 nyligt sekventerede genomer fra Portugal. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) blev ekskluderet fra NCBI-søgningen. M. bovis AF2122/97 bruges normalt som et referencegenom, der skal inkluderes i datasættet. På grund af den offentlige utilgængelighed af hele genomsekvensen repræsenteret af African 1-kloningskomplekset, og det lille antal genomer fra repræsentative stammer af Af2 og Eu1, blev de originale sekventeringsdata leveret af SRA anvendt i disse tilfælde. Zimpel og hans samarbejdspartneres arbejde (2020) hjalp med at identificere genomet fra det førnævnte kloningskompleks og hjalp med at udvælge Mycobacterium bovis til inkludering i datasættet. For Eu3 er kun én type genom beskrevet (Branger et al., 2020), så det genom, vi inkluderer, er en separat repræsentant for Eu3-komplekset.
Globalt omfatter dette datasæt 70 arter af M. bovis fra kvæg isoleret fra 8 værtsarter, fordelt i 12 lande fra 1985 til 2016. 36 arter er betegnet som Eu2, 7 arter er Eu1, 1 art er Eu3, 3 arter er Af1, 4 arter er Af2, og 19 kan ikke tilskrives noget klonalt kompleks (detaljer nedenfor). De detaljerede oplysninger (inklusive accessionsnummeret) om Mycobacterium bovis, der blev anvendt i denne undersøgelse, er vist i tabel 1 og supplerende tabel 1.
42 nyligt sekventerede hele genomer af Mycobacterium bovis fra Portugals hotspots for dyretuberkulose og distribueret i mere end 12 år er centrum for denne undersøgelse, da potentielle sygdomssystemer mellem vilde dyr og husdyr er blevet regelmæssigt overvåget 31,36 (Supplerende figur 1). I henhold til efterfølgende procedurer blev disse stammer isoleret fra kvæg (n = 14), kronhjorte (n = 16) og vildsvin (n = 12) fra 2003 til 2015: indsaml og håndter dyr i overensstemmelse med de anbefalede protokolretningslinjer. Vævsprøverne findes i OIE's Terrestrial Animal Handbook og inokuleres på Stonebrink og Löwenstein-Jensen pyruvat fast medium og flydende medium. Kulturerne inkuberes ved 37 °C, og væksten kontrolleres en gang om ugen i mindst 12 uger. Kolonierne opbevares direkte i en glycerolopløsning ved -80ºC. I det Mycobacterium-selektive medium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) blev de originale arkiverede prøver ført gennem en enkelt in vitro-passage in vitro for at opnå DNA'et fra WGS-programmet. Til dette formål blev den frosne kulturstamopløsning beriget med 5% natriumpyruvat og 10% ADS (50 g albumin, 20 g glukose, 8,5 g natriumchlorid i 1 L vand) på Middlebrook 7H9 ved 37°C Retrain. Efter 4 ugers vækst blev mediet fornyet, og kulturen blev regelmæssigt overvåget, indtil der blev observeret vækst. Cellerne blev høstet ved centrifugering, pelleten blev resuspenderet i 500 µL fosfatbufret saltvand (PBS), opvarmet ved 99 °C i 30 minutter, centrifugeret, og supernatanten blev opbevaret ved -20 °C indtil WGS. Alle procedurer udføres i niveau 3 biosikkerhedsfaciliteter.
WGS-biblioteket med parrede end-genomer fremstilles ved hjælp af det unikke indeks for hver DNA-prøve og bruger Illumina MiSeq-teknologi (2 × 250 pb) (40 prøver) og HiSeq-teknologi (2 × 150 pb) (to isolater) (Eurofins Genomics, Tyskland) til sekventering. I henhold til producentens instruktioner skal Illumina Genome Analyzer med dobbelt-endet modultilbehør bruges til at sekventere det genomiske DNA, og Nextera XT DNA Library Prep Kit fra Illumina skal bruges til at konstruere biblioteket.
Under hensyntagen til dataene fra SRA (n = 12) kan identifikationen af klonkomplekset bruges som metadata for den tilsvarende publikation 30, 41, 43. Når man betragter det komplette genom, bortset fra Mycobacterium bovis AF2122/97 og Mycobacterium bovis 3601, som er anerkendte medlemmer af henholdsvis Eu1- og Eu3-klonkomplekset 25, 29, er det det samme som det komplette genom for Mycobacterium tuberculosis H37Rv (NCBI-tilgangsnummer NC_000962.3). Genomjustering udføres ved hjælp af MAFFT (multiple alignment program of amino acid or nucleotide sequence, version 7.458) og parameter -addfragments48. Derefter søges efter fravær af forskellige klonale komplekser og/eller tilstedeværelsen af SNP-funktioner.
Den nyligt sekventerede Mycobacterium bovis (n = 42) og de originale aflæsninger af det samlede genomudkast (n = 3) justerer komplekset med referencegenomet Mycobacterium tuberculosis H37Rv gennem vSNP-pipelinen og tilstedeværelsen af deletionen og/eller SNP-funktioner fra forskellige kloner. Der blev udført en søgning.
Indsaml information fra manglen på funktioner og/eller tilstedeværelsen/fraværet af SNP og spoligotypningsprofiler for at tildele genomiske data til det tilsvarende klonale kompleks. For de fire udkast til samlinger kan spoligotypningsprofilen ikke udledes, så de er inkluderet i gruppen "ingen kompleksitet".
Den bioinformatiske arbejdsgang, der følges af dette arbejde, starter med de novo-assemblage og kortlægning til en referencestrategi med det formål at udforske rekombinationshændelser og specifikke genompolymorfier. Figur 1 viser et flowdiagram over de følgende trin. Til rekombinationsanalyse anvendes alle genomer til at øge robustheden af inferenser og relaterede indikatorer.
For at reducere fejl i genereringen af genomkonsensussekvenser, opnåede vi først de novo-assembling og derefter core multiple alignments. Unicycler-pipelinen er i øjeblikket tilgængelig på https://github.com/rrwick/Unicycler49 og bruges til at udføre de novo-assembling af 54 sekventerede genomer (42 nyligt sekventerede og 12 fastq-filer gendannet fra SRA). Kort sagt, før assemblering fra bunden, blev der udført en læsekvalitetsanalyse i FastQC version 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) og Trimmomatic version 0.36 (indstillingen "cutting Adapters and other lighting-specific sequences from reads" og "Cut bases from the end of the read, if lower than the threshold quality of 20" anvendes) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50. Derefter blev SPAdes optimizer49 brugt til genomassembling, og Pilon version 1.1851 blev brugt til optimering efter assemblering. En konservativ brodannelsesmetode blev valgt for at undgå forkert samling, og k-mer-størrelsen blev søgt og valgt mellem 20 % og 95 % af læselængden. Følg SPAdes-retningslinjerne, og tag læsestørrelsen i betragtning, slet contigs mindre end 300 bp, og etabler en dækningsgrænse på 20 læsedybder på 52. I de novo-samlingsstrategien blev genomiske regioner, såsom de meget repetitive prolin-glutamat (PE) og prolin-prolin-glutamat (PPE) paraloger, ikke fjernet.
Kvaliteten af de novo-samlingen vurderes via QUAST-pipelinen (http://quast.sourceforge.net/quast.html), som letter fornyelsen af contig og M. bovis AF2122/97-referencegenomet (NCBI-tilgangsnummer LT708304.1) kortlægning (se supplerende tabel 1 for kvalitetsparametre).
Ved hjælp af vSNP-pipelinen (https://github.com/USDA-VS/vSNP) sammenlignes FASTQ-filen for den nyligt sekventerede M. bovis fra Illumina-sekventering med M. bovis AF2122/97-referencegenomet (LT708304.1)). I henhold til bedste praksis-anbefalingerne fra Genome Analysis Toolkit (GATK) [53, 54, 55] anvendes standardfilterparametre eller variantmassescorer til rekalibrering. Resultaterne filtreres ved hjælp af den laveste SAMtools-massescore på 150 og AC = 2. Brug også Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) til at kontrollere aflæsningerne for at udelukke kontaminering. vSNP-pipelinen, der bruges til at kortlægge til sekvenseringsstrategier i vores arbejde, undersøger en række definerede SNP'er og mål og udelukker også blandede infektionsscenarier. Dækningen af det aflæste genom er bedre end 99 % (Supplerende tabel 1).
For at undgå kortlægningsfejl og forkerte SNP'er skal en variant filtreres fra i følgende tilfælde: (1) den understøttes af færre end 20 aflæsninger, (2) den findes med en frekvens på mindre end 0,9, (3) den er i mindst én stamme, men der er i det mindste huller i en anden stamme. Integrated Genomics Viewer (IGV) version 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 blev brugt til visuelt at verificere SNP'er og positioner med kortlægnings- eller justeringsproblemer. Da prolin-glutamat (PE) og prolin-prolin-glutamat (PPE) generne er stærkt duplikerede og er en del af en multigenfamilie, misforstås de let af Illumina-sekventering og fejlkortlægning, så de foretrækkes. Den mykobakterielle bioinformatiske arbejdsgang fjernede medlemmer af tuberkulosekomplekset, når strategien med kortlægning til sekvensering blev brugt for at bekræfte SNP'er. Derfor filtrerede vi PE/PPE-gener og indels fra analysen.
Ifølge Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) er alle SNP'er opdelt i funktionelle kategorier. SnpEff-pipelinen (https://pcingola.github.io/SnpEff/) bruges til at udlede SNP-konsekvenser (synonyme eller ikke-synonyme ændringer). Der blev oprettet en ny database over Mycobacterium bovis AF2122/97-genomet (LT708304.1).
Den multiple core-genomjustering blev udført ved hjælp af Parsnp v1.2, som i øjeblikket er tilgængelig på https://github.com/marbl/parsnp57, med 69 komplette genomer/udkast-assembleringer (med mulighed -c), og M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) blev brugt som reference. Fire multiple core-justeringer blev udført: kun medlemmerne af Eu2-kloningskomplekset (n = 37), inklusive alle medlemmerne af det europæiske kloningskompleks (n = 44), inklusive forbindelsespunktet mellem det europæiske og afrikanske kloningskompleks (n = 51), og inkluderer alle Mycobacterium bovis i dette studie (n = 70).
Kernejusteringen genereret af Parsnp bruges til at udlede det fylogenetiske træ for maksimal sandsynlighed (ML) ved hjælp af CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 med RAxML og udføre 1000 guidede replikationer.
Tre forskellige algoritmer og bioinformatiske værktøjer bruges til at kontrollere for tilstedeværelsen af parallelle rekombinationshændelser: SplitsTree4-software, Gubbins-pipeline (upartisk afstamning gennem rekombination i nukleotidsekvenser) og RDP4-software (rekombinationsdetektionsprogram, version beta 4.101).
Splitdekompositionsmetoden implementeret i SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 bruges til at beregne det rodløse fylogenetiske netværk ved hjælp af Phi-test til statistisk verifikation, og signifikansgrænsen er p = 0,05. Den centrale multi-alignment-analyse af Parsnp bruges som input, og splittedekompositionen som en netværksstandard realiseres.
Gubbins pipeline v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) kører med standardparametre som en anden måde at evaluere virkningen af rekombination på Mycobacterium bovis. Algoritmen, der er implementeret i pipelinen, rekonstruerer den relevante klonafstamning. Den komplette genom-/udkastsamling af vores datasæt og referencegenomet (bovint kvæg AF2122/97, LT708304.1) er gensidigt; og scanner positionen af SNP'en på hver gren af træet for at detektere den SNP-klynge, der repræsenterer rekombinationshændelsen. Grenens nulpunkt. Antag, at der ikke er nogen rekombinationshændelse, hvilket betyder, at de SNP'er, der forekommer på grenen, skal være jævnt fordelt. Kernemultiple alignment fra Parsnp og det bedst scorede ML-træ fra RAxML bruges som inputfiler.
Endelig, for at bekræfte den reorganiseringshændelse, der foreslås af Gubbins-pipelinen, anvendes de seks algoritmer implementeret i RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 og SiScan66) på Parsnps kernemultiple alignment under standardindstillinger. Vi fastslog, at mindst tre af de algoritmer, der er implementeret i RDP4, konsekvent skal demonstrere et vigtigt signal for at verificere hver rekombinationshændelse.
I betragtning af at både Gubbins- og RDP-software søger efter rekombinationssignaler ved at kontrollere de multiple kerneraligneringer i et vindue på op til 500 bp og bekræfte, at inkluderingen af PE/PPE-gener under de novo-assemblage ikke vil interferere med de fundne rekombinationssignaler, udføres yderligere analyse ved hjælp af homolinearitetskontrol af nærheden af det gen, der identificerer rekombinationshændelsen. Det synlineære kort, der bruger det komplette genom, blev konstrueret ved hjælp af MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) for at udelukke lokale genom-translokationer eller inversioner. Derudover blev hele genomet brugt til at udføre homolinearitetsanalyse på aminosyresekvensen via SyntTax-webserveren (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
En mere dybdegående analyse af genomdatasættet fra det portugisiske multi-host tuberculosis-system er at kontrollere polymorfismen af de gener, der er nævnt i litteraturen. Disse gener er 37, 38 og genet, der koder for 3R, opnået af MTBC-forfædrene gennem HGT (DNA-reparation, replikation og rekombination) systemkomponenter 39. Brug ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) og brug DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) til at beregne gendiversitet og nukleotiddiversitet (π) og Tajimas D-neutrale testparameterinput.
Et fylogenetisk træ med maksimal sandsynlighed (ML) baseret på 69 Mycoplasma bovis-isolater og referencegenomer blev opnået (Figur 2A). Sammenlignet med træer baseret på et enkelt gen eller flere lokus, muliggør denne strategi generering af mere kraftfulde træer, der ikke indfanger variabiliteten af hele genomet og derfor udviser en lavere evne til at skelne mellem arter 68,69. ML-træets topologiske struktur er normalt i overensstemmelse med den komplekse klassificering af kloner. Eu2's genom er grupperet i en gren, og Af1's genom er også grupperet sammen (Figur 2A). Resultatet er også i overensstemmelse med det kendte evolutionære forhold mellem Mycobacterium bovis, dvs. der er en stor forskel mellem Eu1-medlemmet og gruppen bestående af alle andre klonale komplekser og genomer, men det klonale kompleks 30 er ikke specificeret. Den lille uoverensstemmelse mellem det klonale kompleks og det observerede forhold på det fylogenetiske træ kan forklares ved, at det klonale kompleks er beskrevet ud fra specifikke genomiske regioner, mens det fylogenetiske træ er baseret på flere alignementer af kernegenomer, der repræsenterer hele genomet.
Det fylogenetiske træ (GTR) med maksimal sandsynlighed er konstrueret baseret på kernegenomjusteringen af Mycobacterium bovis-genomet før (A) og efter (B) fjernelse af rekombinationsstedet. Grenfarverne repræsenterer Mycobacterium bovis-klonkomplekset: Europa 1 er lilla, Europa 2 er rød, Europa 3 er blå, Afrika 1 er orange, og Afrika 2 er grøn. Træet er rodfæstet og tegnet i målestok, og grenlængden måles som en erstatning for hvert sted.
Mycobacterium tuberculosis-komplekset beskrives som klonalt udviklet, og det meste af den evidens, der er akkumuleret gennem årene, understøtter ideen om, at igangværende HGT- og rekombinationshændelser ikke vil forekomme på det detekterbare niveau af MTBC15,17,18.
Tidligere arbejde har vist, at der kan være begrænset rekombination mellem MTBC-stammer20,21, mens andre ikke har kunnet identificere målbare rekombinationshændelser70,71. Gendiskuter dette problem med fokus på Mycobacterium bovis, hvilket er forskelligt fra det tidligere arbejde, der kun betragtede Mycobacterium tuberculosis70,71; eller betragt MTBC som helhed, hvor næsten ingen M. bovis repræsenterer20; eller betragt kun restriktive kvægfraktioner. Mycobacteria-datasættet, i dette arbejde, er der i alt 70 stammer, der repræsenterer alle klonale komplekser, der bruges til at screene for rekombination. Datasættet er skaleret i henhold til fire kumulative niveauer: (1) Eu2-medlemmer, (2) alle europæiske klonkompleksmedlemmer (dvs. Europa), (3) europæisk og afrikansk klonkompleks (Eu + Af) og (4) hele datasamlingen (inklusive genomer, der ikke er inkluderet i nogen allerede beskrevne kloningskomplekser).
For yderligere at undersøge denne hypotese blev der udført et split-dekompositionsnetværk for at vurdere fraværet af rekombinationshændelser mellem genomer, fordi denne metode kan visualisere det forfædrelige forhold mellem individer og vise modstridende fylogenetiske signaler. Alle fire datasæt i analysen bekræftede eksistensen af loops i netværket (dvs. områder, der ikke konvergerer til et enkelt træ), men Phi-testen har ingen statistisk støtte (Eu2, p = 0,0956; Europa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; hele datasættet p = 0,2451), hvilket giver dårlig evidens for eksistensen af reorganiseringshændelser (Figur 3A-D).
I Europa 2 genomer (n = 37) (A), europæiske genomer (n = 44) (B), europæiske og afrikanske genomer (n = 51) (C) og hele datasættet (n = 70) (D).
Efter denne analyse, og under hensyntagen til de cykliske observationer i alle netværk, blev rekonstruktionsalgoritmen implementeret i Gubbins-pipelinen anvendt til at rekonstruere den klonale afstamning og til at supplere estimeringen af effekten af rekombinationen på M. bovis-genomet. Udled det kumulative antal rekombinationshændelser, hvoraf de fleste forekom i terminale grene (dvs. i et enkelt genom) (Tabel 2). Disse indikatorer viser konsistensen af hele datasættet og indikerer, at hyppigheden af rekombinationshændelser er 200 til 300 gange hyppigheden af mutationer. Når rho/theta-parameteren, der repræsenterer de relative rater af rekombination og punktmutationer på grenen, ser ud til at være mellem 0,0037 og 0,0056 (Tabel 3). For nylig viste det publicerede arbejde med 38 M. bovis-stammen en højere rho/theta-værdi (rho/theta = 0,1) end den, der blev opnået i dette datasæt, men Patané og kollegers arbejde brugte referencebaseret assembly til at udlede rekombinationsparametre. En proceduremæssig detalje på grund af assemblyproceduren er blevet forbundet med forekomsten af formodede rekombinationshændelser i den terminale gren.
Dernæst repræsenterer r/m-parameteren diversitetsforholdet mellem rekombination og mutationsintroduktion, og dens gennemsnitsværdi er mellem 0,025 og 0,037, hvilket indikerer, at rekombination sammenlignet med mutationer har en lavere samlet indvirkning på den genetiske diversitet af M. bovis (Tabel 3). Til omfattende sammenligning blev en lignende metode brugt til at estimere r/m-parameteren for MTBC-datasættet bestående af 23 genomer, hvilket viser en gennemsnitsværdi på 0,48620, mens det for Patané og kollegers 38 M. bovis-datasæt viste sig, at gennemsnitsværdien er 0,98. I det første studie var kun to af de 23 genomer inkluderet i M. bovis' arbejde (M. bovis BCG og referencestammen), så den opnåede værdi kan være forudindtaget på grund af overekspression af M. tuberculosis-genomet. I den anden rapport blev de analyserede Mycobacterium bovis-populationer hovedsageligt udvundet fra USA og husdyrværter. I modsætning hertil er flere geografiske placeringer og værtsarter repræsenteret i vores datasæt, og genomer grupperet i forskellige klonale komplekser med forskellige populationsgenetiske karakteristika anvendes også, hvilket opnår en dybere og bredere populationsviden. Forskellen i r/m-gennemsnitsværdien opnået med vores datasæt er i overensstemmelse med konceptet om, at graden af rekombination varierer meget mellem de slægter, der er tildelt den samme taksonomiske art, så disse resultater indikerer, at M. bovis-klonkomplekset kan udvise rekombinationsforskelle. Virkningen er også som foreslået af Didelot & Maiden72. Ikke desto mindre vil en betydelig udvidelse af dette datasæt ved at inkludere et større antal M. bovis-genomer muliggøre yderligere afklaring af dette punkt. Både r/m- og rho/theta-parametrene viser variation mellem grene, og dette resultat er i overensstemmelse med rapporter om andre bakteriearter72,73.
Endelig, for at bekræfte de reorganiseringshændelser, der blev identificeret af Gubbins-pipelinen, blev seks forskellige algoritmer brugt i RDP4-softwaren til uafhængigt at teste forskellige kerne-multisammenligninger. Globalt set blev mindre end halvdelen af de hændelser, der blev identificeret af Gubbins, bekræftet af RDP4 (Tabel 4 og 5). I betragtning af hele datasættet blev tre rekombinationshændelser bekræftet, to involverede interne noder, og den anden involverede et enkelt genom i en terminal gren, for hvilken klonale komplekser ikke kunne tildeles (Tabel 4 og 5). Identifikationen af hændelser i terminale grene kan indikere, at rekombinationen stadig er i gang i nutidige M. bovis-stammer, eller at resultatet er forkert placeret70. I denne hypotetiske rekombinationsregion har cirka 20 % af positionerne udefinerede nukleotider (N), hvilket påvirker rekombinationssignalet (Supplerende figur 2). Derudover påvirker denne region rrs-genet, der koder for 16S ribosomalt RNA, som forventes at være stærkt konserveret, så dette formodede rekombinationssignal kan være resultatet af sekventeringsfejl eller forkert justering. Derefter blev hele genomjusteringen mellem Mb0003 og Mycobacterium bovis AF2122/97 udført, og eksistensen af udefinerede nukleotider og SNP'er blev bekræftet, så de mulige problemer relateret til den forkerte justering skyldtes ikke den biologiske information, der blev implementeret i dette arbejde. Det fremkom efter at have lært programmet at kende.
Der blev ikke fundet huller eller udefinerede nukleotider i rekombinationsregionerne i de interne noder (figur 4 og 5). Med hensyn til disse begivenheder indeholder den ene kun Eu2-genomet og påvirker pks12-genet, som koder for en mulig polyketidsyntase; mens den anden er registreret i Eu1-genomet og påvirker narX-genet, der koder for en mulig nitratreduktase (tabel 4). Generelt viser rekombinationsanalysen, at der er et begrænset antal rekombinationsfragmenter med statistisk understøttelse, og de udledte indikatorer indikerer, at rekombinationen har en lav indvirkning på M. bovis-afstamningen. Rekombinationssignalet forventes at være lavt, men det er vigtigt at skelne det sande evolutionssignal fra baggrundsstøjen, hvilket er en udfordrende opgave. For at reducere støjsignalet introduceret af referencebaseret samling og mismatch-problemer 70, 71, blev alle de andre undtagen det komplette genom samlet fra bunden, og samlingskvaliteten blev kontrolleret og sikret ved QUAST-pipelineanalyse (supplerende tabel 1). Derudover blev der udført en række supplerende analyser for at sikre robustheden og nøjagtigheden af den samlede undersøgelse. Derfor blev sekventeringskvaliteten af narX- og pks12-generne evalueret ved aflæsningskortlægning mod Mycobacterium bovis AF2122/97. Den anbefalede SNP-position i rekombinationsregionen blev bekræftet ved at anvende kriterierne nævnt i metodeafsnittet (mindst 20 aflæsninger og en ændringsfrekvens på 0,9 %). Polymorfien af narX-genet blev fuldt ud bekræftet i de to genomer (Mb1792361 og Mb7240415; 2,3%) og genomerne af pks12-genomet: Mb0891-, Mb1711-, Mb1789-, Mb1870-, Mb17046-, Mb1756- og Mb12-generne. For genomet Mb2043 opfylder seks ud af de otte positioner imidlertid ikke kriteriet for læsedybde, fordi SNP'en understøttes af maksimalt 17 læsninger, hvilket er under den etablerede grænseværdi på 20. Derfor kan rekombinationen af seks genomer (8,6%) på dette genomsted bekræftes (figur 4 og 5).
Den detaljerede visualisering af rekombinationsregionens justering i Mycobacterium bovis-datasættet påvirker narX-genet, der koder for en mulig nitratreduktase. Der blev ikke fundet huller eller udefinerede nukleotider i rekombinationsregionen af de interne noder. Denne specifikke hændelse er registreret i Eu1-genomet. Sekventeringskvaliteten af narX-genet blev evalueret ved at plotte aflæsningerne af Mycobacterium bovis AF2122/97. Bekræft den anbefalede SNP-placering i rekombinationsområdet ved at anvende kriterierne nævnt i metodeafsnittet (mindst 20 aflæsninger og 0,9 ændringsfrekvens). Polymorfien af narX-genet blev fuldt ud bekræftet i genomerne af Mb1792361 og Mb7240415 (2,3%).
Detaljeret visualisering af rekombinationsregionens justering af Mycoplasma bovis-datasættet, der påvirker pks12-genet. Der blev ikke fundet huller eller udefinerede nukleotider i rekombinationsregionen af de interne noder. Med hensyn til hændelsen, der påvirker pks12-genet, der koder for mulig polyketidsyntase, indeholder det kun Eu2-genomet. Sekventeringskvaliteten af pks12 blev evalueret ved hjælp af aflæsningskortlægningen af Mycobacterium bovis AF2122/97. Bekræft den anbefalede SNP-placering i rekombinationsområdet ved at anvende kriterierne nævnt i metodeafsnittet (mindst 20 aflæsninger og 0,9 ændringsfrekvens). Polymorfierne af genomerne Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 og Mb1960 er blevet fuldt bekræftet.
PE- og PPE-gener har repetitive regioner, der let kan fejllæses af Illumina-sekventering og fejlkortlægning, så de slettes normalt kun fra bioinformatik-workflowet for M. tuberculosis-medlemmer, når kortlægning-til-sekvens-strategien anvendes. Inferensen af rekombinationshændelser, der anvendes i dette arbejde, er baseret på de novo-assemblage uden at filtrere PE/PPE fra. Vi mener, at ved at implementere tre forskellige komplementære metoder og algoritmer via SplitsTree, Gubbins pipeline og RDP4-software, er de anvendte strategier robuste til at behandle og filtrere de reorganiserede regioner forårsaget af fejlsignaler. For at udelukke interferens fra PE/PPE-genet på Gubbins- og RDP4-softwaren for at identificere SNP-klynger og dermed identifikationen af de rekombinationsregioner, der formodes at påvirke narX- og pks12-generne, blev nabolaget mellem disse gener imidlertid undersøgt (Supplerende figur 3-5). I M. bovis AF2122/97 er narX-genet adskilt af narK2 og Mb1764c, mens pks12 er omgivet af Mb2075c og Mb2073c (Supplerende Figur 3-5). Kortet genereret ved hjælp af MAUVE synline-kortet af det komplette genom giver information om gensekvensbevarelse og -omlejring og viser fire kollineære blokke og ingen tegn på genomtranslokation eller inversion. Derudover beviste komplementeringsanalysen med aminosyresekvensen homologien i alle de komplette genomer, og der blev ikke fundet nogen PE/PPE i de tilstødende regioner af narX eller pks12. For narX har ét genom (Mb0030) en lavere synonymscore, fordi narX-genet blev identificeret som to fragmenter (fragment 1891 og 1890). For pks12 udviste Mb0030 og Mb003 lavere synlinearitetsscorer på grund af ligheder, mens pks12 blev identificeret i henholdsvis to og tre fragmenter, der repræsenterer forskellige domæner af proteinet (Supplerende Figur 3-5). Under hensyntagen til denne information, og Gubbins og RDP4 software udfører begge analyser, kontrollerer vi kernens multiple alignment af de maksimale 500 bp i vinduet, og bekræftede, at PE/PPE genet ikke vil interferere med rekombinationssignalet, der påvirker narX og pks12.
Selvom de rekombinationssignaler, der er detekteret i dette datasæt, kan betragtes som residuelle, er det sandt, at rekombination i M. bovis ikke kan udelukkes, så det bør fortsat være genstand for yderligere analyse, hvor hele genomer fra forskellige epidemiologiske scenarier sekventeres til vigtige.
Sammenligning af de fylogenetiske ML-træer opnået før og efter rekombinationskorrektion (figur 2A, B) førte ikke til signifikante ændringer i det udledte fylogenetiske forhold, og M. bovis-stammerne var grupperet i den samme gruppe.
Efter kortlægning af 42 nyligt sekventerede M. bovis-aflæsninger med referencegenomet for M. bovis AF2122/97 blev der opnået en SNP-justering indeholdende 1816 polymorfe positioner. De fleste SNP'er (87,1%) er placeret i den kodende region, og de berørte gener er karakteriseret i henhold til de funktionelle kategorier vist i Bovilist (Figur 6A, B). Under hensyntagen til det samlede antal gener i hver funktionel kategori viste generne i kategorien "lipidmetabolisme" flere SNP'er, efterfulgt af "cellevæg og celleprocesser" og "mellemliggende metabolisme og respiration", hvilket afslører, at de er i M. bovis-evolutionen.
Hierarkisk analyse af M. bovis-datasættet fra Portugal (n = 42). Det samlede antal registrerede SNP'er og berørte gener for hver funktionel kategori (A). Det samlede antal synonyme og ikke-synonyme ændringer registreret efter funktionskategori (B).
På globalt plan er det gennemsnitlige dN/dS-forhold bedre end 1,5, hvilket indikerer, at det globale evolutionære pres er at slippe af med den oprindelige tilstand og repræsenterer et positivt (diversificeret eller rettet) og/eller afslappet oprensningsvalgscenarie. I kategorierne "virulens, afgiftning, tilpasning", "indsættelsessekvenser og fager" og "regulatoriske proteiner" er mere end to tredjedele af SNP'erne ikke-synonyme (figur 6B).
I alle kategorier er der gener med flere SNP'er, hvilket resulterer i en gennemsnitlig mutationsrate (dvs. den gennemsnitlige SNP pr. gen) større end 1 (Figur 6A). Pks12 (Mb2074c) med 15 SNP'er og fas (Mb2553c) med 8 SNP'er har højere mutationsværdier. Begge disse gener er involveret i fedtsyremetabolisme. pks-genet koder for polyketidsyntase (PKS), som er et multifunktionelt enzym involveret i mykobakterielle cellevægges lipidbiosyntese74,75. Dette gen koder for et multifunktionelt polypeptid, der er involveret i syntesen af mycoketider74,76. fas-genet er involveret i syntesen af mycolsyre. Begge disse gener spiller en vigtig rolle i biosyntesen af cellevæggen i kontakt med værten.
For yderligere at studere udviklingen af Mycobacterium bovis blev to sæt specifikke gener analyseret. Tidligere publicerede arbejder, der brugte sekvenssammensætning og fylogenetiske metoder, identificerede gener, der blev erhvervet af MTBC-forfædre gennem HGT før diversificering37,38. Disse gener er anført i Supplerende Tabel 2. SNP-fordelingen af i alt 77 gener, der kan være relateret til HGT, blev analyseret, og 26 polymorfe steder blev identificeret, hvilket i de fleste tilfælde (78%) resulterede i ikke-synonyme (NS) ændringer (Supplerende Tabel 2). Tidligere arbejde med MTBC-genomet viste, at den formodede HGT-region udviser et højere NS SNP-forhold sammenlignet med resten af genomet. Hvis man mener, at disse rekombinationsregioner blev erhvervet af MTBC-forfædre, og derfor overrepræsenterer de gamle polymorfier, forventes andelen af synonyme ændringer at være højere, fordi NS-substitutioner forventes at blive elimineret ved negativ selektion på grund af aminosyreændringer, der kan ændre proteinets funktion. Derfor indikerer vores resultater, at de funktionelle konsekvenser kan stamme fra udskiftningen af HGT-lignende gener, hvilket afspejler deres betydning for værdifuld adaptiv genetisk diversitet.
Parallelt med denne analyse blev generne, der koder for komponenterne i 3R-systemet (DNA-reparation, replikation og rekombination), grundigt undersøgt i overensstemmelse med den liste, der tidligere er offentliggjort af dos Vultos og samarbejdspartnere (2008)39. Udvekslingen af identiske DNA-fragmenter kan ikke observeres direkte, selvom det kan være en hyppig proces, når nært beslægtede bakterier er involveret, som i tilfældet med dette datasæt. Derudover kan denne proces være nøglen til DNA-reparationsmetoder72, så den kan spille en rolle i homolog rekombination. I alt 26 polymorfe positioner fordelt på 54 gener blev identificeret (Supplerende Tabel 3). I dette sæt af gener tegnede NS-ændringer sig for omkring 65% af konsekvenserne, hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporter om Mycobacterium tuberculosis-stammer.
Opslagstidspunkt: 21. oktober 2021