Täname teid Nature'i külastamise eest. Teie kasutataval brauseriversioonil on CSS-i jaoks piiratud tugi. Parima kogemuse saamiseks soovitame teil kasutada brauseri uuemat versiooni (või lülitada Internet Exploreris ühilduvusrežiim välja). Samal ajal kuvame jätkuva toe tagamiseks saite ilma stiilide ja JavaScriptita.
Genoomi sekveneerimine on taaselustanud nakkushaiguste uurimise valdkonna, paljastades haiguste epidemioloogia, patogeneesi, peremeesorganismi ja patogeeni vastastikmõju ning patogeenidele pealesurutud evolutsioonilise protsessi. Mycobacterium tuberculosis kompleks (MTBC) peab Mycobacterium bovist üheks oma adaptiivseks liikmeks, mis põhjustab tuberkuloosi (TB) maismaaimetajatel ja on tüüpiline bakterite evolutsiooni mudel. Nagu teisedki MTBC liikmed, eeldatakse, et Mycobacterium bovis on rangelt kloonitud, aeglaselt arenev patogeen ning rekombinatsiooni või horisontaalse geeniülekande märke pole ilmselgelt näha. Selles töös rakendame võrdlevat genoomikat 70 veise M.-st koosnevale kogu genoomi sekventsi (WGS) andmestikule, mis pärineb erinevatest sugupuudest (Euroopa ja Aafrika), et saada ülevaade veise M. geneetilisest mitmekesisusest. Evolutsiooniline jõud. Reorganiseerumise tunnuste hindamiseks kasutatakse kolme erinevat meetodit. Ülemaailmselt on tuvastatud väike arv rekombinatsioonisündmusi ja kinnitatud kahe sõltumatu meetodi abil, millel on kindel alus. Sellest hoolimata on rekombinatsioonil mutatsioonidega võrreldes M. bovise mitmekesisusele nõrgem mõju (üldine r/m = 0,037). Meie andmestikus Mycobacterium bovise klonaalses kompleksis saadud r/m keskmise erinevus on kooskõlas üldise kontseptsiooniga, et rekombinatsiooni aste võib sama taksonoomilise liigi alla kuuluvate liinide vahel oluliselt erineda. Selle töö põhjal ei saa Mycobacterium bovise rekombinatsiooni välistada, seega peaks see olema edasiste võrdleva genoomika uuringute objekt, kus maailma eri epidemioloogiliste stsenaariumide suurte andmekogumite WGS on ülioluline. Seejärel viidi läbi täiendav analüüs väiksema Mycobacterium bovise andmekogumi (n = 42) põhjal, mis pärines mitme peremeesorganismi tuberkuloosi levimusest, ja tuvastati üle 1800 lookuse, millest vähemalt ühel tüvel esines ühe nukleotiidi polümorfism (SNP). Enamik (87,1%) asub kodeerivas piirkonnas ja sünonüümsete muutuste mittesünonüümsete muutuste (dN/dS) globaalne suhe ületab 1,5, mis näitab, et positiivne valik on oluline M. bovise suhtes mõjuv evolutsiooniline jõud. Suurem osa SNP-sid tuvastati geenides, mis on rikkad funktsionaalsete kategooriate "lipiidide metabolism", "rakukesta ja rakuprotsessid" ning "vahepealne metabolism ja hingamine" poolest, mis näitab nende potentsiaali Mycobacterium bovise bioloogias ja evolutsioonis. Lähemal vaatlusel MTBC esivanemate geenidest, mis on altid horisontaalsele geeniülekandele ja kuuluvad 3R (DNA parandamine, replikatsioon ja rekombinatsioon) süsteemi, ilmneb Taijima D-neutraalse testi globaalne keskmine negatiivne väärtus, mis viitab varasemale selektiivsele skaneerimisele. Hiljutine kitsaskoht pärast populatsiooni laienemist on endiselt peamine evolutsiooniline liikumapanev tegur, mis paneb kohustusliku patogeeni Mycobacterium bovise peremeesorganismiga võitlema.
Mycobacterium tuberculosis kompleks (MTBC) on üks edukamaid bakteriaalsete patogeenide taksoneid ja tüüpiline bakterite evolutsiooni juhtum. Selle liikmetel on genoomilisel tasandil üllatavalt kõrge nukleotiidide identsus (> 99%)1,2. Erinevad MTBC ökotüübid võivad põhjustada tuberkuloosi (TB), mis on nakkuslik granulomatoosne haigus, laias valikus peremeesliikides, alates mikroimetajatest kuni inimesteni3,4,5. Praegu hõlmab kompleks inimesi [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] ja loomadega kohanenud patogeene (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" ja "dassie")5,6. M. canettii (tuntud ka kui "Nodobacter glabrata") keskmine nukleotiidide identsus eelmainitud mükobakteritega on 98% ja võrdlev genoomika on näidanud, et M. canettii ja ülejäänud MTBC on hiljuti ühisest esivanemast lahknenud.7 Seda kontseptsiooni arvesse võttes nimetavad mõned autorid M. canettii MTBC liikmeks 8.
MTBC-d kirjeldatakse süstemaatiliselt kui ranget klonaalset kompleksi ning selle populatsiooni struktuuri reguleerivad selgelt vähenenud mitmekesisus, kitsaskohad, selektiivne skaneerimine ja geneetiline triiv9,10. Eeldades, et keerulist ranget klonaalset evolutsiooni, näiteks puuduvaid polümorfisme, ei saa rekombinatsiooni teel taastada, on diferentsiaalpiirkonna (RD) genoomse deletsiooni ja TbD1 (Mtb-spetsiifilise deletsiooni 1 piirkonna) järjestikused sündmused pakutud MTBC evolutsiooni molekulaarsete markeritena2,5,11. Võrdlev genoomika ja kogu genoomi sekveneerimise (WGS) töö toetab inimese poolt kohanenud liikmete jagunemist üheksaks liiniks (Mycobacterium tuberculosis L1 kuni L4, L7 ja L8; ning Mycobacterium africanum L5, L6 ja L9), liinidel L2 kuni L4 on ühine deletsioon TbD1 piirkonnas2,11,12,13. Lisaks pakutakse välja, et loomadega kohanenud liikmetel on ühine esivanem, mida defineerivad klaadispetsiifilised deletsioonid RD7, RD8, RD9 ja RD102, 5 ja 14.
Horisontaalset geeniülekannet (HGT) ja rekombinatsiooni peetakse haruldasteks ning need esinevad MTBC esivanematel, mitte kogu MTBC liikme erineva ajaloo tõttu15,16,17. Kaks varajast aruannet Hughes'i ja kaastöötajate (2002) ning Gutackeri ja kaastöötajate (2006) poolt näitasid, et rekombinatsioonisündmused võivad aidata kujundada polümorfisme, mis tähistavad spetsiifilisi lookusi M. tuberculosis tüvedes18,19. MTBC rekombinatsiooni ilmse puudumise põhjused on: (1) HGT mehaaniline protsess ja võime kadumine; (2) HGT sündmuste haruldus; (3) rekombinatsioonisündmuste võimalus MTBC nišis puudub14,17. Hiljuti on mõned MTBC tüve 20 ja Mycobacterium bovis 21 suhtes rakendatud kogu genoomi sekveneerimise (WGS) uuringud andnud tõendeid rekombinatsiooni kohta, mis on esimesed, mis näitavad, et MTBC tüved vahetavad sageli väikeseid DNA fragmente, kuid piiratud nukleotiidjärjestuse varieeruvuse tõttu pole neid sündmusi endiselt täheldatud.
Mycobacterium bovis on kariloomadelt (peamiselt veistelt) kõige sagedamini eraldatav MTBC liige, kuigi seda saab eraldada ka vabapidamisel ja aiaga piiratud metsloomadelt4,22,23,24. M. bovis arenes spoligotüüpimise profiili, spetsiifiliste deletsioonide ja ühe nukleotiidi polümorfismide (SNP-de)25, 26, 27, 28, 29 kohaselt viieks peamiseks klonaalseks kompleksiks [Euroopa 1 (Eu1), Euroopa 2 (Eu2), Euroopa 3 (Eu3), Aafrika 1 (Af1) ja Aafrika 2 (Af2)]. Need klonaalsed kompleksid näitavad Mycobacterium bovise populatsiooni mitmekesist struktuuri ja selle seost geograafiliste piirkondadega. Lisaks kavandas Zimpeli ja kaastöötajate (2020) hiljutine WGS-i töö Mycobacterium bovis'e SNP-l põhineva fülogeneesi, millel on üle 1900 genoomi, mis näitab, et on vähemalt neli erinevat liini (nimega Lb1 kuni Lb1 kuni Lb4), kuid need ei ole täielikult kooskõlas eelnevalt määratletud klonaalse kompleksiga, kuigi geograafilist spetsiifilisust saab samuti kinnitada30. Need autorid viisid läbi fülogeneesi diferentsiaalanalüüsi ja molekulaarset dateerimist, kuid ei uurinud rekombinatsiooni30.
Varasem töö, milles on kasutatud erinevaid molekulaarseid tehnikaid, nagu spoligotüüpimine, MIRU-VNTR (mükobakterite vahelduvate korduste ühiku-muutuja tandemkorduste arv) ja hiljutine SNP-tüüpimine, näitas M. bovis'e tüvede seas teatud geneetilise mitmekesisuse taset 31,32,33, 34,35. Geneetilise varieeruvuse diferentseerimine on muutunud oluliseks tööriistaks haiguste epidemioloogia uurimisel, mis on abiks patogeneesi, virulentsuse ja haiguste leviku põhjalikul mõistmisel. WGS-meetodi tekkimine annab võimaluse paljastada Mycobacterium bovis'e genoomi poolt erinevate peremeesorganismide ja epidemioloogiliste stsenaariumidega kohanemise ja püsimise protsessis kehtestatud evolutsioonilisi liikumapanevaid tegureid.
Selles töös kasutame võrdlevat genoomset analüüsi erinevatel Mycoplasma bovise andmekogumitel (n = 70), sealhulgas erinevatest klonaalsetest kompleksidest pärinevatel isolaatidel, et saada ülevaade Mycoplasma bovise evolutsiooniprotsessist, eriti fülogeneetiliste seoste ja rekombinatsioonisündmuste lahendamiseks. Selle analüüsi täiendusena uuriti täiendavalt Portugali hästi iseloomustatud mitme peremeesorganismiga tuberkuloosi piirkonnast saadud M. bovise isolaatide (n = 42) alamandmekogumit,31,36, et järeldada identiteedi puudumist. Senss- (dN) ja sünonüümsete (dS) nukleotiidide asenduste suhtelise suhte tasakaal ning kirjanduses mainitud spetsiifiliste genoomide evolutsiooniline panus on 37,38 saadud MTBC esivanemate poolt HGT kaudu ja kodeerivad 3R (DNA parandamise, replikatsiooni ja rekombinatsiooni) süsteemi geenikomponente 39. Valige HGT kaudu saadud geenid, kuna need võivad esindada iidseid polümorfisme, seega on oodata, et need võivad sisaldada suuremat osakaalu sünonüümseid muutusi. 3R-süsteemi kaasatud geenid valiti välja seetõttu, et varasem töö M. tuberculosis tüvedega näitas üldiseid negatiivseid/puhastavaid valikuid, mis nende geenide puhul toimivad, ja need võivad evolutsioonis olulist rolli mängida39. Selle töö teine eesmärk on järeldada reorganiseerumissündmuste olemasolu. Arvestades, et meie Portugali andmestik sisaldab ainult Euroopa kloonikompleksi 2 genoome ja tüvesid, mis ei ole kloonikompleksi määranud, otsustasime lisada avalikult kättesaadavad genoomiandmed, et saada lõpuks kõigi kloonikomplekside esinduslikkus ning parandada tulemuste usaldusväärsust ja ulatust.
Selle töö keskmes on 42 äsja sekveneeritud Mycoplasma bovise genoomi Portugali endeemilisest mitme peremeesorganismi tuberkuloosi stseenist (üksikasjad allpool), mida on varem epidemioloogilisest vaatenurgast iseloomustatud36. Arvestades, et Portugali andmestik sisaldab ainult Euroopa 2 klooni komplekside ja ilma määratud kompleksideta tüvede esindajaid, on lisatud avalikult kättesaadavad täisgenoomi sekveneerimise andmed, et laiendada andmestikku, mis hõlmab kõiki M. bovise kloonikomplekside esindajaid. Seetõttu kasutati selles töös kolme täisgenoomi sekveneerimise andmeallikat: täielik/mustandgenoomi assamblee, kuni 10 karkassi, mis on salvestatud NCBI-s (National Center for Biotechnology Information) (n = 15 isolaati); salvestatud SRA-s (Illumina fastq fail järjestuse lugemise arhiivis), mis esindab M. bovise kloonide kompleksset mitmekesisust (n = 12 isolaati)30; ja 42 äsja sekveneeritud genoomi Portugalist. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) jäeti NCBI otsingust välja. M. bovis AF2122/97 kasutatakse tavaliselt andmestikku lisatava võrdlusgenoomina. Kuna Aafrika 1 kloonimiskompleksi esindatud kogu genoomi järjestus pole avalikult kättesaadav ja Af2 ja Eu1 representatiivsete tüvede genoomide arv on väike, kasutati nendel juhtudel SRA esitatud algseid sekveneerimisandmeid. Zimpeli ja tema kaastöötajate töö (2020) aitas tuvastada eelmainitud kloonimiskompleksi genoomi ja aitas valida Mycobacterium bovise andmestikku lisamiseks. Eu3 puhul on kirjeldatud ainult ühte tüüpi genoomi (Branger jt, 2020), seega on meie kaasatud genoom Eu3 kompleksi eraldi esindaja.
Ülemaailmselt hõlmab see andmestik 70 veise M. bovis'e isendit, kes on isoleeritud 8 peremeesliigist ja levinud 12 riigis aastatel 1985–2016. 36 liiki on tähistatud kui Eu2, 7 liiki on Eu1, 1 liik on Eu3, 3 liiki on Af1, 4 liiki on Af2 ja 19 liiki ei ole omistatavad ühelegi klonaalsele kompleksile (üksikasjad allpool). Selles uuringus kasutatud Mycobacterium bovis'e üksikasjalik teave (sh registreerimisnumber) on esitatud tabelis 1 ja lisatabelis 1.
Selle uuringu keskmes on 42 äsja sekveneeritud Mycobacterium bovise täisgenoomi Portugali loomade tuberkuloosi levialadelt, mis on levinud enam kui 12 aastat, kuna potentsiaalseid metsloomade ja kariloomade haigussüsteeme on regulaarselt jälgitud31,36 (lisajoonis 1). Järgnevate protseduuride kohaselt eraldati need tüved veistelt (n = 14), punahirvelt (n = 16) ja metssealt (n = 12) aastatel 2003–2015: loomi tuleb koguda ja käidelda vastavalt soovitatud protokollijuhistele. Koeproovid on OIE maismaaloomade käsiraamatus ning need on inokuleeritud Stonebrinki ja Löwenstein-Jenseni püruvaadi tahkele söötmele ja vedelale söötmele. Kultuure inkubeeritakse temperatuuril 37 °C ja kasvu kontrollitakse üks kord nädalas vähemalt 12 nädala jooksul. Kolooniaid säilitatakse otse glütseroolilahuses temperatuuril -80 °C. Mycobacterium'i selektiivses söötmes (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics) lasti algsed arhiveeritud proovid läbi ühe in vitro passaaži, et saada WGS-programmi DNA. Selleks rikastati külmutatud kultuurilahust Middlebrook 7H9 söötmes temperatuuril 37 °C (Retrain) 5% naatriumpüruvaadi ja 10% ADS-iga (50 g albumiini, 20 g glükoosi, 8,5 g naatriumkloriidi 1 l vees). Pärast 4-nädalast kasvu söödet uuendati ja kultuuri jälgiti regulaarselt, kuni täheldati kasvu. Rakud koguti tsentrifuugimise teel, pellet resuspendeeriti 500 µl fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS), kuumutati temperatuuril 99 °C 30 minutit, tsentrifuugiti ja supernatanti säilitati temperatuuril -20 °C kuni WGS-ini. Kõik protseduurid viiakse läbi 3. taseme bioohutuse ruumides.
WGS-i paarisotsaga genoomiteek valmistatakse iga DNA-proovi unikaalse indeksi abil ning sekveneerimiseks kasutatakse Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 proovi) ja HiSeq (2 × 150 pb) (kaks isolaati) tehnoloogiat (Eurofins Genomics, Saksamaa). Genoomse DNA sekveneerimiseks kasutage tootja juhiste kohaselt Illumina genoomianalüsaatorit kaheotsalise moodulkinnitusega ja teeki loomiseks Illumina Nextera XT DNA raamatukogu ettevalmistuskomplekti.
Võttes arvesse SRA-st saadud andmeid (n = 12), saab kloonikompleksi identifitseerimist kasutada vastava publikatsiooni 30, 41, 43 metaandmetena. Täieliku genoomi puhul, välja arvatud Mycobacterium bovis AF2122/97 ja Mycobacterium bovis 3601 puhul, mis on vastavalt Eu1 ja Eu3 kloonikompleksi 25, 29 äratuntavad liikmed, on see sama mis Mycobacterium tuberculosis H37Rv (NCBI registreerimisnumber NC_000962.3) täielik genoom. Genoomi joondamine viiakse läbi MAFFT (aminohapete või nukleotiidjärjestuse mitmekordse joondamise programm, versioon 7.458) ja parameetri -addfragments48 abil. Seejärel otsitakse erinevate kloonkomplekside puudumist ja/või SNP tunnuste olemasolu.
Äsja sekveneeritud Mycobacterium bovis (n = 42) ja kokkupandud genoomi mustandi algsed lugemised (n = 3) joondavad kompleksi võrdlusgenoomi Mycobacterium tuberculosis H37Rv-ga vSNP torujuhtme ja erinevate kloonide deletsiooni- ja/või SNP-tunnuste olemasolu kaudu. Viidi läbi otsing.
Koguge teavet tunnuste puudumise ja/või SNP-de olemasolu/puudumise ning spoligotüüpimisprofiilide kohta, et määrata genoomsed andmed vastavale klonaalsele kompleksile. Nelja mustandikomplekti puhul ei saa spoligotüüpimisprofiili järeldada, seega on need lisatud "keerukuseta" rühma.
Selle töö bioinformaatika töövoog algab de novo kokkupanekust ja kaardistamisest kuni võrdlusstrateegiani, mille eesmärk on uurida rekombinatsioonisündmusi ja spetsiifilisi genoomi polümorfisme. Joonis 1 annab järgitud sammude vooskeem. Rekombinatsioonianalüüsis kasutatakse kõiki genoome, et suurendada järelduste ja nendega seotud indikaatorite usaldusväärsust.
Genoomi konsensusjärjestuste genereerimisel esinevate vigade vähendamiseks teostasime esmalt de novo kokkupaneku ja seejärel mitmekordsed põhijoondused. Unicycleri torujuhe on praegu saadaval aadressil https://github.com/rrwick/Unicycler49 ja seda kasutatakse 54 sekveneeritud genoomi (42 äsja sekveneeritud ja 12 SRA-st taastatud fastq-faili) de novo kokkupanekuks. Lühidalt, enne nullist kokkupanekut teostati lugemiskvaliteedi analüüs FastQC versioonis 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) ja Trimmomatic versioonis 0.36 (rakendatakse valikuid "adapterite ja muude valgustusspetsiifiliste järjestuste lõikamine lugemistest" ja "aluste lõikamine lugemise lõpust, kui kvaliteet on madalam kui 20 läviväärtus") (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 50. Seejärel kasutati genoomi kokkupanekuks SPAdes optimeerijat49 ja kokkupanekujärgseks optimeerimiseks Piloni versiooni 1.1851. Vale kokkupaneku vältimiseks valiti konservatiivne sildamisrežiim ning otsiti ja valiti k-meeri suurus vahemikus 20% kuni 95% lugemispikkusest. Järgige SPAdes'i juhiseid ja arvestage lugemispikkusega, kustutage kontiigid, mis on väiksemad kui 300 bp, ja määrake 20 lugemissügavuse katvuse piirväärtuseks 52. De novo kokkupanekustrateegias ei eemaldatud genoomseid piirkondi, nagu näiteks väga korduvad proliin-glutamaadi (PE) ja proliin-proliinglutamaadi (PPE) paraloogid.
De novo komplekti kvaliteeti hinnatakse QUAST-torujuhtme (//quast.sourceforge.net/quast.html) kaudu, mis hõlbustab kontiigi ja M. bovis AF2122/97 referentsgenoomi (NCBI registreerimisnumber LT708304.1) kaardistamise uuendamist (kvaliteediparameetrite kohta vt lisa tabelit 1).
vSNP torujuhtme (https://github.com/USDA-VS/vSNP) abil võrreldakse Illumina sekveneerimisest saadud äsja sekveneeritud M. bovise FASTQ-faili M. bovise AF2122/97 referentsgenoomiga (LT708304.1). Genoomi analüüsi tööriistakomplekti (GATK) 53, 54, 55 parimate tavade soovituste kohaselt rakendatakse ümberkalibreerimiseks standardseid filtriparameetreid või variantide massiskoori. Tulemused filtreeritakse, kasutades madalaimat SAMtoolsi massiskoori 150 ja AC = 2. Saastumise välistamiseks kasutage näitude kontrollimiseks ka Krakenit (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/). Meie töös sekveneerimisstrateegiatega kaardistamiseks kasutatav vSNP torujuhe uurib mitmeid määratletud SNP-sid ja sihtmärke ning välistab ka segainfektsiooni stsenaariumid. Loetud genoomi katvus on parem kui 99% (lisa tabel 1).
Kaardistamisvigade ja valede SNP-de vältimiseks filtreerige variant välja järgmistel juhtudel: (1) seda toetab vähem kui 20 näitu, (2) seda leitakse sagedusega alla 0,9, (3) see esineb vähemalt ühes tüves, kuid vähemalt teises tüves on lünki. SNP-de ja positsioonide visuaalseks kontrollimiseks kaardistamis- või joondamisprobleemidega kasutati integreeritud genoomikavaaturi (IGV) versiooni 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56. Kuna proliin-glutamaadi (PE) ja proliin-proliinglutamaadi (PPE) geenid on väga dubleeritud ja kuuluvad mitme geeni perekonda, on Illumina sekveneerimise ja vale kaardistamise puhul neid lihtne valesti mõista, seega eelistatakse neid. Mükobakterite bioinformaatika töövoog eemaldas tuberkuloosikompleksi liikmed, kui SNP-de kinnitamiseks kasutati järjestusele kaardistamise strateegiat. Seetõttu filtreerisime analüüsist välja PE/PPE geenid ja indelid.
Bovilisti (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) andmetel jagunevad kõik SNP-d funktsionaalsetesse kategooriatesse. SNP-de tagajärgede (sünonüümsed või mittesünonüümsed muutused) järeldamiseks kasutatakse SnpEffi torujuhet (https://pcingola.github.io/SnpEff/). Loodud on uus Mycobacterium bovis AF2122/97 genoomi andmebaas (LT708304.1).
Tuuma genoomi mitmekordne joondamine viidi läbi Parsnp v1.2 abil, mis on praegu saadaval aadressil https://github.com/marbl/parsnp57, kasutades 69 täielikku genoomi/mustandi komplekti (valikuga -c) ja võrdlusena kasutatakse M. bovis AF2122/97 (LT708304.1). Viidi läbi neli tuuma mitmekordset joondamist: ainult Eu2 kloonimiskompleksi liikmed (n = 37), sealhulgas kõik Euroopa kloonimiskompleksi liikmed (n = 44), sealhulgas Euroopa ja Aafrika kloonimiskompleksi ühenduspunkt (n = 51), ning kõik Mycobacterium bovis'e liikmed selles uuringus (n = 70).
Parsnp-i genereeritud südamiku joondust kasutatakse maksimaalse tõenäosusega (ML) fülogeneetilise puu tuletamiseks, kasutades CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 ja RAxML-i, ning 1000 juhendatud replikatsiooni teostamiseks.
Rekombinatsioonisündmuste esinemise paralleelseks kontrollimiseks kasutatakse kolme erinevat algoritmi ja bioinformaatika tööriista: SplitsTree4 tarkvara, Gubbinsi (erapooletu liini tuvastamine nukleotiidjärjestuste rekombinatsiooni kaudu) torujuhe ja RDP4 (rekombinatsiooni tuvastamise programm, versioon beeta 4.101) tarkvara.
Juurteta fülogeneetilise võrgustiku arvutamiseks kasutatakse SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59-s rakendatud lõhestatud dekompositsiooni meetodit, statistiliseks kontrolliks Phi-testi ja olulisuse lävi on p = 0,05. Sisendina kasutatakse Parsnp-i põhilist mitmekordse joondamise analüüsi ning lõhestav dekompositsioon realiseeritakse võrgustiku standardina.
Gubbinsi torujuhe v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) töötab vaikeparameetritega, mis on veel üks viis rekombinatsiooni mõju hindamiseks Mycobacterium bovis'ele. Torujuhtmes rakendatud algoritm rekonstrueerib asjakohase klooniliini. Meie andmestiku täielik genoomi/mustandi komplekt ja võrdlusgenoom (veise bord AF2122/97, LT708304.1) on vastastikku ühendatud ja skaneerivad SNP positsiooni puu igal harul, et tuvastada rekombinatsioonisündmust esindav SNP klaster. Haru nullpunkt Eeldatakse, et rekombinatsioonisündmust ei ole, mis tähendab, et harul esinevad SNP-d peaksid olema ühtlaselt jaotunud. Sisendfailidena kasutatakse Parsnp-st pärinevat põhilist mitmekordset joondust ja RAxML-ist pärinevat parima hindega ML-puud.
Lõpuks, Gubbinsi torujuhtme pakutud reorganiseerimissündmuse kinnitamiseks rakendatakse Parsnp-i põhilisele mitmekordsele joondamisele vaikesätetega RDP467-s rakendatud kuut algoritmi (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 ja SiScan66). Leidsime, et vähemalt kolm RDP4-s rakendatud algoritmi peavad iga rekombinatsioonisündmuse kinnitamiseks järjepidevalt demonstreerima olulist signaali.
Arvestades, et nii Gubbins kui ka RDP tarkvara otsivad rekombinatsioonisignaale, kontrollides põhijärjestuste mitmekordset joondamist kuni 500 bp aknas ja kinnitades, et PE/PPE geenide kaasamine de novo kokkupaneku ajal ei häiri leitud rekombinatsioonisignaale, tehakse edasine analüüs homolineaarsuse abil, kontrollides rekombinatsioonisündmust tuvastava geeni lähedust. Täieliku genoomi kasutav sünlineaarne kaart konstrueeriti MAUVE-multi-genome joondamist (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) kasutades, et välistada lokaalsed genoomi translokatsioonid või inversioonid. Lisaks kasutati kogu genoomi aminohappejärjestuse homolineaarsuse analüüsi tegemiseks SyntTax veebiserveri (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) kaudu.
Portugali multi-host tuberkuloosi süsteemist saadud genoomiandmestiku põhjalikum analüüs seisneb kirjanduses mainitud geenide polümorfismi kontrollimises. Need geenid on 37, 38 ja 3R-i kodeeriv geen, mille MTBC esivanemad said HGT (DNA parandamise, replikatsiooni ja rekombinatsiooni) süsteemi komponentide kaudu 39. Geenide mitmekesisuse ja nukleotiidide mitmekesisuse (π) ning Tajima D neutraalse testi parameetrite sisendi arvutamiseks kasutage ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) ja DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/).
Saadi 69 Mycoplasma bovis isolaadi ja referentsgenoomi põhjal maksimaalse tõenäosusega (ML) fülogeneetiline puu (joonis 2A). Võrreldes ühe geeni või mitme lookuse baasil loodud puudega võimaldab see strateegia genereerida võimsamaid puid, mis ei haara kogu genoomi varieeruvust ja seetõttu on neil väiksem võime liike 68,69 eristada. ML-puu topoloogiline struktuur on tavaliselt kooskõlas kloonide keerulise klassifikatsiooniga. Eu2 genoom on koondunud harusse ja ka Af1 genoom on koondunud ühte klastrisse (joonis 2A). Tulemus on kooskõlas ka Mycobacterium bovis'e teadaoleva evolutsioonilise seosega, see tähendab, et Eu1 liikme ja kõigi teiste klonaalsete komplekside ja genoomide rühma vahel on suur erinevus, kuid klonaalset kompleksi 30 ei ole täpsustatud. Kloonkompleksi ja fülogeneetilisel puul täheldatud seose vahelist väikest vastuolu saab seletada asjaoluga, et kloonkompleksi kirjeldatakse spetsiifiliste genoomsete piirkondade põhjal, samas kui fülogeneetiline puu põhineb kogu genoomi esindavate tuumgenoomide mitmel joondamisel.
Maksimaalse tõenäosusega fülogeneetiline puu (GTR) konstrueeritakse Mycobacterium bovise genoomi tuumgenoomi joondumise põhjal enne (A) ja pärast (B) rekombinatsioonisaidi eemaldamist. Okste värvid esindavad Mycobacterium bovise kloonikompleksi: Euroopa 1 on lilla, Euroopa 2 on punane, Euroopa 3 on sinine, Aafrika 1 on oranž ja Aafrika 2 on roheline. Puu on juurdunud ja joonistatud skaala järgi ning oksa pikkust mõõdetakse iga saidi asendajana.
Mycobacterium tuberculosis kompleksi kirjeldatakse klonaalselt arenenuna ning enamik aastate jooksul kogunenud tõenditest toetab ideed, et käimasolevad HGT ja rekombinatsiooni sündmused ei toimu tuvastataval MTBC tasemel15,17,18.
Varasemad tööd on näidanud, et MTBC tüvede vahel võib esineda piiratud rekombinatsiooni20,21, samas kui teised ei ole suutnud tuvastada mõõdetavaid rekombinatsioonisündmusi70,71. Arutage seda küsimust uuesti, keskendudes Mycobacterium bovisele, mis erineb varasemast tööst, mis käsitles ainult Mycobacterium tuberculosis't70,71; või käsitlege MTBC-d tervikuna, kus M. bovis't peaaegu ei esinda20; või arvestage ainult piiravate veisefraktsioonidega. Käesoleva töö mükobakterite andmestikus on kokku 70 tüve, mis esindavad kõiki klonaalseid komplekse, mida kasutatakse rekombinatsiooni skriinimiseks. Andmekogum on skaleeritud vastavalt neljale kumulatiivsele tasemele: (1) Eu2 liikmed, (2) kõik Euroopa kloonikompleksi liikmed (st Euroopa), (3) Euroopa ja Aafrika kloonikompleks (Eu + Af) ja (4) kogu andmekogum (sealhulgas genoomid, mis ei kuulu ühtegi juba kirjeldatud kloonimiskompleksi).
Selle hüpoteesi edasiseks uurimiseks viidi läbi jagatud dekompositsioonivõrgustik, et hinnata genoomide vaheliste rekombinatsioonisündmuste puudumist, kuna see meetod võimaldab visualiseerida indiviidide vahelist esivanemate suhet ja kuvada vastuolulisi fülogeneetilisi signaale. Kõik neli analüüsis osalenud andmekogumit kinnitasid võrgustikus silmuste olemasolu (st alad, mis ei koondu üheks puuks), kuid Phi-testil puudub statistiline tugi (Eu2, p = 0,0956; Euroopa, p = 0,1637; Eu + Af p = 0,2774; kogu andmekogum p = 0,2451), mis annab reorganiseerumissündmuste olemasolu kohta nõrku tõendeid (joonis 3A-D).
Euroopas 2 genoomi (n = 37) (A), Euroopa genoomid (n = 44) (B), Euroopa ja Aafrika genoomid (n = 51) (C) ning kogu andmestik (n = 70) (D).
Pärast seda analüüsi ja võttes arvesse tsüklilisi vaatlusi kõigis võrkudes, rakendati Gubbinsi torujuhtmes rakendatud rekonstrueerimisalgoritmi klonaalse liini rekonstrueerimiseks ja rekombinatsiooni mõju hinnangu täiendamiseks M. bovise genoomile. Järeldati rekombinatsioonisündmuste kumulatiivset arvu, millest enamik toimus terminaalsetes harudes (st ühes genoomis) (tabel 2). Need näitajad näitavad kogu andmestiku järjepidevust ja näitavad, et rekombinatsioonisündmuste sagedus on 200–300 korda suurem kui mutatsioonide sagedus. Kui rho/theta parameeter, mis esindab rekombinatsiooni ja punktmutatsioonide suhtelist kiirust harul, näib olevat vahemikus 0,0037 kuni 0,0056 (tabel 3). Hiljuti avaldatud 38 M. bovis tüve töö näitas kõrgemat rho/theta väärtust (rho/theta = 0,1) kui selles andmestikus saadud, kuid Patané ja tema kolleegide töös kasutati rekombinatsiooniparameetrite tuletamiseks võrdluspõhist assambleed. Protseduuriline detail, mis on tingitud assamblee protseduurist, on seostatud oletatavate rekombinatsioonisündmuste rohkusega terminaalharus.
Järgmisena esindab r/m parameeter rekombinatsiooni ja mutatsioonide sissetoomise mitmekesisuse suhet ning selle keskmine väärtus jääb vahemikku 0,025–0,037, mis näitab, et võrreldes mutatsioonidega on rekombinatsioonil M. bovise geneetilisele mitmekesisusele väiksem üldine mõju (tabel 3). Ulatuslikuks võrdluseks kasutati sarnast meetodit r/m parameetri hindamiseks 23 genoomist koosneva MTBC andmestiku jaoks, mille keskmine väärtus oli 0,48620, samas kui Patané ja kolleegide 38 M. bovise andmestiku puhul näitas see keskmiseks väärtuseks 0,98. Esimeses uuringus kaasati M. bovise töösse ainult kaks 23 genoomist (M. bovis BCG ja võrdlustüvi), seega võib saadud väärtus olla M. tuberculosis'e genoomi üleekspressiooni tõttu kallutatud. Teises aruandes pärinesid analüüsitud Mycobacterium bovise populatsioonid peamiselt Ameerika Ühendriikidest ja kariloomadelt. Seevastu meie andmestikus on esindatud rohkem geograafilisi asukohti ja peremeesliike ning kasutatakse ka genoome, mis on rühmitatud erinevatesse klonaalsetesse kompleksidesse, millel on erinevad populatsiooni geneetilised omadused, saavutades seeläbi sügavama ja laiema populatsioonialase teadmise. Meie andmestikuga saadud r/m keskmise väärtuse erinevus on kooskõlas kontseptsiooniga, et rekombinatsiooni aste varieerub sama taksonoomilise liigi alla määratud liinide vahel oluliselt, seega näitavad need tulemused, et M. bovise kloonikompleksis võivad esineda rekombinatsioonierinevused. Mõju on ka Didelot & Maideni72 pakutud. Sellest hoolimata võimaldab selle andmestiku märkimisväärne laiendamine suurema arvu M. bovise genoomide lisamisega seda punkti veelgi selgitada. Nii r/m kui ka rho/theta parameetrid näitavad harude vahelist varieeruvust ja see tulemus on kooskõlas teiste bakteriliikide kohta tehtud aruannetega72,73.
Lõpuks, Gubbinsi torujuhtme poolt tuvastatud reorganiseerimissündmuste kinnitamiseks kasutati RDP4 tarkvaras kuut erinevat algoritmi, et testida sõltumatult erinevaid põhilisi mitmekordseid võrdlusi. Üldiselt kinnitas RDP4 vähem kui pooled Gubbinsi poolt tuvastatud sündmustest (tabelid 4 ja 5). Arvestades kogu andmestikku, kinnitati kolm rekombinatsioonisündmust, millest kaks hõlmasid sisemisi sõlmi ja üks hõlmas ühte genoomi terminaalharus, millele klonaalseid komplekse ei saanud määrata (tabelid 4 ja 5). Sündmuste tuvastamine terminaalharudes võib viidata sellele, et rekombinatsioon on tänapäevastes M. bovise tüvedes endiselt pooleli või on tulemus valesse kohta paigutatud70. Selles hüpoteetilises rekombinatsioonipiirkonnas on ligikaudu 20% positsioonidest määratlemata nukleotiidid (N), mis mõjutavad seega rekombinatsioonisignaali (lisajoonis 2). Lisaks mõjutab see piirkond rrs geeni, mis kodeerib 16S ribosomaalset RNA-d, mis eeldatavasti on väga konserveerunud, seega võib see oletatav rekombinatsioonisignaal olla sekveneerimisvigade või joondamise tulemus. Seejärel teostati kogu genoomi joondamine Mb0003 ja Mycobacterium bovis AF2122/97 vahel ning kinnitati määratlemata nukleotiidide ja SNP-de olemasolu, seega vale joondamisega seotud võimalikud probleemid ei tulenenud käesolevas töös rakendatud bioloogilisest teabest, mis ilmnes pärast programmi õppimist.
Sisemiste sõlmede rekombinatsioonipiirkondades ei leitud lünki ega määratlemata nukleotiide (joonised 4 ja 5). Nende sündmuste osas sisaldab üks ainult Eu2 genoomi ja mõjutab pks12 geeni, mis kodeerib võimalikku polüketiidsüntaasi; teine aga on registreeritud Eu1 genoomis ja mõjutab narX geeni, mis kodeerib võimalikku nitraatreduktaasi (tabel 4). Üldiselt näitab rekombinatsioonianalüüs, et statistiliselt toetatud rekombinatsioonifragmentide arv on piiratud ja järeldatud indikaatorid viitavad sellele, et rekombinatsioonil on M. bovise liinile väike mõju. Rekombinatsioonisignaal peaks olema madal, kuid on oluline eristada tegelikku evolutsioonisignaali taustamürast, mis on keeruline ülesanne. Viitepõhiste kokkupaneku- ja mittevastavusprobleemide 70, 71 tekitatud mürasignaali vähendamiseks pandi kõik ülejäänud peale täieliku genoomi nullist kokku ning kokkupaneku kvaliteeti kontrolliti ja tagati QUAST-i torujuhtme analüüsiga (lisatabel 1). Lisaks viidi läbi rida täiendavaid analüüse, et tagada üldise uuringu usaldusväärsus ja täpsus. Seetõttu hinnati narX ja pks12 geenide sekveneerimise kvaliteeti lugemiskaardistamise abil Mycobacterium bovis AF2122/97 suhtes. Soovitatav SNP positsioon rekombinatsioonipiirkonnas kinnitati meetodi osas mainitud kriteeriumide rakendamisega (vähemalt 20 lugemist ja 0,9 muutussagedus). NarX geeni polümorfism kinnitati täielikult kahes genoomis (Mb1792361 ja Mb7240415; 2,3%) ja pks12 genoomi genoomides: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756 ja Mb12 geenid. Kuid genoomi Mb2043 puhul ei vasta kaheksast positsioonist kuus lugemissügavuse kriteeriumile, kuna SNP-d toetab maksimaalselt 17 lugemist, mis on alla kehtestatud piirväärtuse 20. Seega saab kinnitada kuue genoomi (8,6%) rekombinatsiooni selles genoomi saidil (joonised 4 ja 5).
Mycobacterium bovise andmestiku rekombinatsioonipiirkonna joondamise detailne visualiseerimine mõjutab narX geeni, mis kodeerib võimalikku nitraatreduktaasi. Sisemiste sõlmede rekombinatsioonipiirkonnas ei leitud lünki ega määratlemata nukleotiide. See konkreetne sündmus on registreeritud Eu1 genoomis. NarX geeni sekveneerimise kvaliteeti hinnati Mycobacterium bovise AF2122/97 lugemite graafikule kandmise teel. Kinnitage soovitatav SNP asukoht rekombinatsioonipiirkonnas, rakendades meetodi osas mainitud kriteeriume (vähemalt 20 lugemist ja 0,9 muutussagedust). NarX geeni polümorfism leidis täielikku kinnitust Mb1792361 ja Mb7240415 genoomides (2,3%).
Mycoplasma bovise andmestiku pks12 geeni mõjutavate rekombinatsioonipiirkondade joondamise detailne visualiseering. Sisemiste sõlmede rekombinatsioonipiirkondades ei leitud lünki ega määratlemata nukleotiide. Mis puudutab sündmust, mis mõjutab võimalikku polüketiidsüntaasi kodeerivat pks12 geeni, siis see sisaldab ainult Eu2 genoomi. pks12 sekveneerimise kvaliteeti hinnati Mycobacterium bovise AF2122/97 lugemiskaardistamise abil. Kinnitage soovitatav SNP asukoht rekombinatsioonipiirkonnas, rakendades meetodi osas mainitud kriteeriume (vähemalt 20 lugemist ja 0,9 muutumissagedust). Genoomide Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043 ja Mb1960 polümorfismid on täielikult kinnitatud.
PE ja PPE geenidel on korduvad piirkonnad, mida Illumina sekveneerimine ja vale kaardistamine kergesti valesti loevad, seega kustutatakse need M. tuberculosis liikmete bioinformaatika töövoost tavaliselt ainult järjestuse-kaardistamise strateegia kasutamisel. Selles töös rakendatud rekombinatsioonisündmuste järeldamine põhineb de novo kokkupanekul ilma PE/PPE välja filtreerimata. Usume, et rakendades kolme erinevat üksteist täiendavat meetodit ja algoritmi SplitsTree, Gubbinsi torujuhtme ja RDP4 tarkvara kaudu, on rakendatud strateegiad vastupidavad veasignaalide põhjustatud reorganiseeritud piirkondade töötlemisele ja filtreerimisele. Kuid selleks, et välistada PE/PPE geeni sekkumine Gubbinsi ja RDP4 tarkvarasse SNP-klastrite tuvastamisel ja seega ka narX ja pks12 geene mõjutavate rekombinatsioonipiirkondade tuvastamisel, uuriti nende geenide naabrust (lisajoonis 3–5). M. bovis AF2122/97 puhul on narX geen eraldatud narK2 ja Mb1764c poolt, samas kui pks12 on ümbritsetud Mb2075c ja Mb2073c poolt (lisajoonis 3-5). Täieliku genoomi MAUVE sünliinikaardi abil loodud kaart annab teavet geenijärjestuse konserveerumise ja ümberpaigutuse kohta, näidates nelja kollineaarset plokki ning genoomi translokatsiooni või inversiooni märke ei ole. Lisaks tõestas aminohappejärjestusega komplementatsioonianalüüs homoloogiat kõigis täielikes genoomides ning narX või pks12 külgnevates piirkondades ei leitud PE/PPE-d. NarX puhul on ühel genoomil (Mb0030) madalam sünonüümia skoor, kuna narX geen identifitseeriti kahe fragmendina (fragmendid 1891 ja 1890). pks12 puhul näitasid Mb0030 ja Mb003 sarnasuste tõttu madalamaid sünlineaarsuse skoori, samas kui pks12 identifitseeriti vastavalt kahes ja kolmes fragmendis, mis esindavad valgu erinevaid domeene (lisajoonis 3-5). Võttes arvesse seda teavet ning Gubbinsi ja RDP4 tarkvara analüüsi, kontrollides aknas maksimaalse 500 bp südamiku mitmekordset joondamist, kinnitasime, et PE/PPE geen ei häiri narX-i ja pks12-d mõjutavat rekombinatsioonisignaali.
Kuigi selles andmekogumis tuvastatud rekombinatsioonisignaale võib pidada jääkideks, on tõsi, et rekombinatsiooni M. bovis'es ei saa välistada, seega peaks see olema edasise analüüsi objektiks, mille käigus sekveneeritakse erinevate epidemioloogiliste stsenaariumide terved genoomid oluliseks.
Rekombinatsioonikorrektsiooni eel ja pärast saadud ML fülogeneetiliste puude võrdlemine (joonis 2A, B) ei toonud kaasa olulisi muutusi järeldatud fülogeneetilises seoses ning M. bovis'e tüved olid koondunud samasse rühma.
Pärast 42 äsja sekveneeritud M. bovise rea kaardistamist M. bovise AF2122/97 referentsgenoomiga saadi SNP joondus, mis sisaldas 1816 polümorfset positsiooni. Enamik SNP-sid (87,1%) paikneb kodeerivas piirkonnas ja mõjutatud geene iseloomustatakse Bovilistis näidatud funktsionaalsete kategooriate järgi (joonis 6A, B). Võttes arvesse iga funktsionaalse kategooria geenide koguarvu, näitasid "lipiidide metabolismi" kategooria geenid rohkem SNP-sid, millele järgnesid "rakuseina ja rakuprotsessid" ning "vahepealne metabolism ja hingamine", mis näitab, et need osalevad M. bovise evolutsioonis.
Portugali M. bovise andmestiku hierarhiline analüüs (n = 42). Iga funktsionaalse kategooria registreeritud SNP-de ja mõjutatud geenide koguarv (A). Funktsioonikategooria kaupa registreeritud sünonüümsete ja mittesünonüümsete muutuste koguarv (B).
Globaalsel skaalal on keskmine dN/dS suhe parem kui 1,5, mis näitab, et globaalne evolutsiooniline surve on vabaneda esivanemate olekust ning esindab positiivset (mitmekesise või suunatud) ja/või lõdvestunud puhastusvaliku stsenaariumi. Kategooriates "virulentsus, detoksifitseerimine, adaptatsioon", "insertsioonijärjestused ja faagid" ning "regulatoorsed valgud" on enam kui kaks kolmandikku SNP-dest mittesünonüümsed (joonis 6B).
Kõigis kategooriates on geene, millel on mitu SNP-d, mille tulemuseks on keskmine mutatsioonimäär (st keskmine SNP geeni kohta) üle 1 (joonis 6A). Pks12 (Mb2074c) 15 SNP-ga ja fas (Mb2553c) 8 SNP-ga omavad kõrgemaid mutatsiooniväärtusi. Mõlemad geenid osalevad rasvhapete metabolismis. pks geen kodeerib polüketiidsüntaasi (PKS), mis on multifunktsionaalne ensüüm, mis osaleb mükobakterite rakuseina lipiidide biosünteesis74,75. See geen kodeerib multifunktsionaalset polüpeptiidi, mis osaleb mükoketiidide sünteesis74,76. Fas geen osaleb mükoolhappe sünteesis. Mõlemad geenid mängivad olulist rolli peremeesorganismiga kokkupuutuva rakuseina biosünteesis.
Mycobacterium bovise evolutsiooni edasiseks uurimiseks analüüsiti kahte spetsiifiliste geenide komplekti. Varem avaldatud tööd, mis kasutasid järjestuse koostise ja fülogeneetilisi meetodeid, tuvastasid geenid, mille MTBC esivanemad omandasid HGT kaudu enne mitmekesistamist37,38. Need geenid on loetletud lisatabelis 2. Analüüsiti kokku 77 geeni SNP jaotust, mis võivad olla seotud HGT-ga, ja tuvastati 26 polümorfset saiti, mis enamikul juhtudel (78%) põhjustasid mittesünonüümseid (NS) muutusi (lisatabel 2). Varasem töö MTBC genoomi kohta näitas, et oletataval HGT piirkonnal on kõrgem NS SNP suhe võrreldes ülejäänud genoomiga. Kui arvata, et need rekombinatsioonipiirkonnad omandasid MTBC esivanemad ja seetõttu esindavad nad üle iidseid polümorfisme, siis eeldatakse, et sünonüümsete muutuste osakaal on suurem, kuna NS asendused eeldatavasti elimineeritakse negatiivse valiku teel aminohapete muutuste tõttu, mis võivad muuta valgu funktsiooni. Seega näitavad meie tulemused, et funktsionaalsed tagajärjed võivad tuleneda HGT-sarnaste geenide asendamisest, mis peegeldab nende olulisust väärtusliku adaptiivse geneetilise mitmekesisuse jaoks.
Paralleelselt selle analüüsiga uuriti põhjalikult 3R (DNA parandamise, replikatsiooni ja rekombinatsiooni) süsteemi komponente kodeerivaid geene vastavalt dos Vultose ja kaastöötajate (2008)39 varem avaldatud loetelule. Identsete DNA fragmentide vahetust ei saa otseselt jälgida, kuigi see võib olla sagedane protsess, kui tegemist on lähedaste bakteritega, nagu selle andmekogumi puhul; lisaks võib see protsess olla DNA parandamise meetodite72 võti, seega mängib see rolli homoloogilises rekombinatsioonis. Kokku tuvastati 26 polümorfset positsiooni, mis olid jaotunud 54 geeni vahel (lisa tabel 3). Selles geenikogumis moodustasid NS muutused umbes 65% tagajärgedest, mis on kooskõlas varasemate aruannetega Mycobacterium tuberculosis tüvede kohta.
Postituse aeg: 21. okt 2021