تخمین‌های ژنومی نوترکیبی، جهش و انتخاب مثبت، محرک‌های متنوعی از مایکوباکتریوم بویس را القا می‌کنند

از بازدید شما از نیچر متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین تجربه، توصیه می‌کنیم از نسخه جدیدتر مرورگر استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در اینترنت اکسپلورر خاموش کنید). در عین حال، برای اطمینان از ادامه پشتیبانی، سایت‌ها را بدون استایل‌ها و جاوا اسکریپت نمایش خواهیم داد.
توالی‌یابی ژنوم، حوزه تحقیقات بیماری‌های عفونی را احیا کرده و اپیدمیولوژی بیماری، پاتوژنز، تعاملات میزبان-پاتوژن و فرآیند تکاملی تحمیل‌شده بر پاتوژن‌ها را آشکار می‌سازد. کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (MTBC)، مایکوباکتریوم بوویس را به عنوان یکی از اعضای تطبیقی ​​حیوانی خود که باعث بیماری سل (TB) در پستانداران خشکی‌زی می‌شود، در نظر می‌گیرد و یک مدل معمول از تکامل باکتریایی است. مانند سایر اعضای MTBC، مایکوباکتریوم بوویس به عنوان یک پاتوژن کاملاً کلون شده و به آرامی در حال تکامل فرض می‌شود و بدیهی است که هیچ نشانه‌ای از نوترکیبی یا انتقال افقی ژن وجود ندارد. در این کار، ما ژنومیک مقایسه‌ای را بر روی یک مجموعه داده توالی کل ژنوم (WGS) متشکل از 70 گاو M. از شجره‌نامه‌های مختلف (اروپا و آفریقا) اعمال می‌کنیم تا بینش‌هایی در مورد تنوع ژنتیکی گاو M. به دست آوریم. قدرت تکاملی. سه روش مختلف برای تخمین نشانه‌های سازماندهی مجدد استفاده می‌شود. در سطح جهانی، تعداد کمی از رویدادهای نوترکیبی توسط دو روش مستقل با پشتیبانی قوی شناسایی و تأیید شده‌اند. با این وجود، در مقایسه با جهش‌ها، نوترکیبی تأثیر ضعیف‌تری بر تنوع M. bovis دارد (r/m کلی = 0.037). میانگین تفاوت r/m به‌دست‌آمده در کمپلکس کلونال مایکوباکتریوم بوویس در مجموعه داده‌های ما با این مفهوم کلی سازگار است که درجه نوترکیبی ممکن است بین دودمان‌های اختصاص‌یافته به گونه‌های طبقه‌بندی یکسان، بسیار متفاوت باشد. بر اساس این کار، نوترکیبی در مایکوباکتریوم بوویس را نمی‌توان رد کرد، بنابراین باید موضوع تلاش‌های بیشتر در تحقیقات ژنومیک مقایسه‌ای آینده باشد، که در آن WGS مجموعه داده‌های بزرگ از سناریوهای مختلف اپیدمیولوژیک در سراسر جهان بسیار مهم است. سپس تجزیه و تحلیل اضافی بر روی مجموعه داده‌های کوچکتر مایکوباکتریوم بوویس (n = 42) از شیوع سل چند میزبانه انجام شد و بیش از 1800 جایگاه شناسایی شد که حداقل یک سویه یک پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی (SNP) را نشان داد. بیشتر آنها (۸۷.۱٪) در ناحیه کدکننده قرار دارند و نسبت جهانی تغییرات غیر مترادف (dN/dS) به تغییرات مترادف از ۱.۵ فراتر می‌رود، که نشان می‌دهد انتخاب مثبت یک نیروی تکاملی مهم است که بر M. bovis اعمال می‌شود. نسبت بالاتری از SNPها در ژن‌های غنی از دسته‌های عملکردی "متابولیسم لیپید"، "دیواره سلولی و فرآیندهای سلولی" و "متابولیسم و ​​تنفس میانی" شناسایی شدند که پتانسیل آنها را در زیست‌شناسی و تکامل مایکوباکتریوم بوویس نشان می‌دهد. نگاهی دقیق‌تر به ژن‌های اجداد MTBC که مستعد انتقال افقی ژن هستند و در سیستم ۳R (ترمیم، تکثیر و نوترکیبی DNA) گنجانده شده‌اند، میانگین جهانی مقدار منفی تست خنثی D تایجیما را نشان می‌دهد که نشان دهنده اسکن انتخابی گذشته است. تنگنای اخیر پس از گسترش جمعیت هنوز عامل اصلی محرک تکاملی برای پاتوژن اجباری مایکوباکتریوم بوویس برای مبارزه با میزبان است.
کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (MTBC) یکی از موفق‌ترین گونه‌های پاتوژن‌های باکتریایی و نمونه‌ای بارز از تکامل باکتریایی است. اعضای آن به طرز شگفت‌آوری هویت نوکلئوتیدی بالایی را در سطح ژنومی نشان می‌دهند (> 99%)1،2. اکوتیپ‌های مختلف MTBC می‌توانند باعث بیماری سل (TB)، که یک بیماری گرانولوماتوز عفونی است، در طیف وسیعی از گونه‌های میزبان از پستانداران کوچک گرفته تا انسان شوند3،4،5. در حال حاضر، این کمپلکس شامل انسان [M. Tuberculosis (Mtb)، مایکوباکتریوم آفریکانوم] و پاتوژن‌های سازگار با حیوانات (مایکوباکتریوم بوویس، مایکوباکتریوم کاپیتوم، مایکوباکتریوم پینی‌پدوم، مایکوباکتریوم میکروتوباکتر، مایکوباکتریوم مونجی، مایکوباکتریوم میسانی، مایکوباکتریوم سوریکا، "باسیل شامپانزه" و "داسی") 5،6 می‌شود. M. canettii (همچنین با نام "Nodobacter glabrata" شناخته می‌شود). میانگین تشابه نوکلئوتیدی با مایکوباکتری‌های فوق‌الذکر ۹۸٪ است و کارهای ژنومیک مقایسه‌ای نشان داده است که M. canettii و بقیه MTBC اخیراً از جد مشترک خود جدا شده‌اند.7 با توجه به این مفهوم، برخی از نویسندگان M. canettii را عضو MTBC 8 می‌نامند.
MTBC به طور سیستماتیک به عنوان یک کمپلکس کلونال دقیق توصیف می‌شود و ساختار جمعیت آن به وضوح توسط کاهش تنوع، تنگناها، اسکن انتخابی و رانش ژنتیکی کنترل می‌شود9،10. با فرض تکامل کلونال دقیق پیچیده، مانند پلی‌مورفیسم‌های از دست رفته که نمی‌توان آنها را با نوترکیبی بازیابی کرد. بر اساس این فرض، رویدادهای متوالی حذف ژنومی ناحیه افتراقی (RD) و TbD1 (ناحیه حذف اختصاصی Mtb 1) به عنوان نشانگرهای مولکولی تکامل MTBC پیشنهاد شده‌اند2،5،11. ژنومیک مقایسه‌ای و توالی‌یابی کل ژنوم (WGS) از تقسیم اعضای سازگار شده با انسان به نه دودمان (مایکوباکتریوم توبرکلوزیس L1 تا L4، L7 و L8؛ و مایکوباکتریوم آفریکانوم L5، L6 و L9) پشتیبانی می‌کند، دودمان‌های L2 تا L4 ناحیه TbD1 را حذف مشترک می‌کنند2،11،12،13. علاوه بر این، پیشنهاد می‌شود که اعضای سازگار با حیوانات، یک جد مشترک دارند که با حذف‌های خاص کلاد در RD7، RD8، RD9 و RD102، 5 و 14 تعریف می‌شود.
انتقال افقی ژن (HGT) و رویدادهای نوترکیبی نادر تلقی می‌شوند و در اجداد MTBC رخ می‌دهند، نه در تاریخچه متفاوت کل عضو MTBC15،16،17. دو گزارش اولیه توسط هیوز و همکارانش (2002) و گوتاکر و همکارانش (2006) نشان داد که رویدادهای نوترکیبی ممکن است به شکل‌گیری پلی‌مورفیسم‌هایی که جایگاه‌های خاصی را در سویه‌های M. tuberculosis نشان می‌دهند، کمک کنند. دلایل فقدان آشکار نوترکیبی در MTBC عبارتند از: (1) فرآیند مکانیکی و از دست دادن توانایی HGT؛ (2) نادر بودن رویدادهای HGT؛ (3) هیچ شانسی برای رویدادهای نوترکیبی در جایگاه MTBC وجود ندارد.14،17 اخیراً، برخی مطالعات تعیین توالی کل ژنوم (WGS) که بر روی سویه MTBC 20 و مایکوباکتریوم بوویس 21 انجام شده است، شواهدی از نوترکیبی ارائه داده‌اند که اولین شواهدی است که نشان می‌دهد سویه‌های MTBC اغلب قطعات کوچک DNA را مبادله می‌کنند، اما به دلیل تنوع محدود توالی نوکلئوتیدی، این رویدادها هنوز مورد توجه قرار نگرفته‌اند.
مایکوباکتریوم بوویس رایج‌ترین عضو MTBC بازیابی شده از دام‌ها (عمدتاً گاو) است، اگرچه می‌توان آن را از حیوانات وحشی آزاد و محصور نیز جدا کرد4،22،23،24. مایکوباکتریوم بوویس بر اساس مشخصات اسپولیگوتایپینگ، حذف‌های خاص و پلی‌مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدی (SNPs) 25، 26، 27، 28، 29 در ژن‌های خاص، به پنج کمپلکس کلونال اصلی [اروپایی 1 (Eu1)، اروپایی 2 (Eu2)، اروپایی 3 (Eu3)، آفریقایی 1 (Af1) و آفریقایی 2 (Af2)] تکامل یافته است. این کمپلکس‌های کلونال، ساختار متنوع جمعیت مایکوباکتریوم بوویس و ارتباط آن با مناطق جغرافیایی را نشان می‌دهند. علاوه بر این، کار اخیر WGS که توسط زیمپل و همکارانش (2020) انجام شد، یک فیلوژنی را بر اساس SNP مایکوباکتریوم بوویس، با بیش از 1900 ژنوم، طراحی کرد که نشان می‌دهد حداقل چهار دودمان مختلف (به نام‌های Lb1 تا Lb1 تا Lb4) وجود دارد، که کاملاً با کمپلکس کلونال تعریف شده قبلی سازگار نیستند، اگرچه ویژگی جغرافیایی نیز قابل تأیید است30. این نویسندگان تجزیه و تحلیل افتراقی فیلوژنی و تاریخ‌گذاری مولکولی را انجام دادند، اما نوترکیبی را مطالعه نکردند30.
کارهای قبلی با استفاده از تکنیک‌های مولکولی مختلف، مانند اسپولیگوتایپینگ، MIRU-VNTR (تعداد تکرار پشت سر هم متغیر واحد تکرار پراکنده مایکوباکتریایی) و تایپینگ SNP اخیر، سطح مشخصی از تنوع ژنتیکی را در بین سویه‌های M. bovis نشان داد 31،32،33، 34،35. تمایز تنوع ژنتیکی به ابزاری مهم در مطالعه اپیدمیولوژی بیماری تبدیل شده است که برای درک عمیق پاتوژنز، حدت و انتقال بیماری مفید است. ظهور روش WGS امکان آشکارسازی عوامل محرک تکاملی اعمال شده توسط ژنوم مایکوباکتریوم بوویس را در فرآیند سازگاری و پایداری با میزبان‌های مختلف و سناریوهای اپیدمیولوژیک فراهم می‌کند.
در این کار، ما از تجزیه و تحلیل ژنومی مقایسه‌ای بر روی مجموعه داده‌های مختلف مایکوپلاسما بوویس (n=70)، از جمله جدایه‌هایی از کمپلکس‌های کلونال مختلف، برای کسب بینش در مورد فرآیند تکاملی مایکوپلاسما بوویس، به ویژه برای حل روابط فیلوژنتیکی و رویدادهای نوترکیبی، استفاده می‌کنیم. به عنوان مکمل این تجزیه و تحلیل، یک مجموعه زیرداده از جدایه‌های M. bovis (n = 42) که از یک منطقه سل چند میزبانه با ویژگی مشخص در پرتغال 31،36 به دست آمده است، بیشتر مورد بررسی قرار گرفت تا عدم هویت را استنباط کند. تعادل بین نسبت نسبی جایگزینی‌های نوکلئوتیدی سنس (dN) به مترادف (dS)، و همچنین سهم تکاملی ژنوم‌های خاص ذکر شده در مقالات، آنها 37،38 هستند که توسط اجداد MTBC از طریق HGT به دست آمده‌اند و اجزای ژن سیستم 3R (ترمیم، تکثیر و نوترکیبی DNA) 39 را رمزگذاری می‌کنند. ژن‌های به دست آمده از طریق HGT را انتخاب کنید زیرا ممکن است نشان دهنده پلی‌مورفیسم‌های باستانی باشند، بنابراین انتظار می‌رود که آنها ممکن است نسبت بالاتری از تغییرات مترادف داشته باشند. ژن‌های موجود در سیستم 3R انتخاب شدند زیرا کار قبلی روی سویه‌های M. tuberculosis نشان‌دهنده انتخاب‌های منفی/خالص‌سازی عمومی بود که روی این ژن‌ها کار می‌کنند و ممکن است نقش مهمی در تکامل 39 داشته باشند. هدف دیگر این کار، استنباط وجود رویدادهای سازماندهی مجدد است. به همین دلیل، با توجه به اینکه مجموعه داده‌های ما از پرتغال فقط شامل ژنوم‌های کمپلکس کلون اروپایی 2 و سویه‌هایی است که کمپلکس کلون را اختصاص نداده‌اند، تصمیم گرفتیم داده‌های ژنوم در دسترس عموم را نیز لحاظ کنیم تا در نهایت نماینده‌ای از همه کمپلکس‌های کلون به دست آوریم و استحکام و وسعت نتایج را بهبود بخشیم.
42 ژنوم مایکوپلاسما بوویس که به تازگی از صحنه سل چند میزبانه بومی پرتغال (جزئیات زیر) توالی‌یابی شده‌اند، که قبلاً از دیدگاه اپیدمیولوژیک36 مشخص شده‌اند، محور این کار هستند. با توجه به اینکه مجموعه داده‌های پرتغال فقط شامل نمایندگانی از کمپلکس‌های کلون 2 اروپایی و سویه‌های بدون کمپلکس‌های تعیین‌شده است، داده‌های توالی‌یابی کل ژنوم که در دسترس عموم است، برای گسترش مجموعه داده‌هایی که شامل همه نمایندگان کمپلکس‌های کلون M. bovis است، اضافه شده است. بنابراین، در این کار از سه منبع داده توالی‌یابی کل ژنوم استفاده شد: مونتاژ ژنوم کامل/پیش‌نویس، تا 10 داربست ذخیره شده در NCBI (مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی) (n = 15 ایزوله)؛ ذخیره شده در SRA (فایل Illumina fastq از بایگانی توالی خوانده شده) نشان دهنده تنوع پیچیده کلون‌های M. bovis (n = 12 ایزوله)30؛ و 42 ژنوم تازه توالی‌یابی شده از پرتغال. مایکوباکتریوم بوویس BCG (باسیل کالمت-گورین) از جستجوی NCBI حذف شد. M. bovis AF2122/97 معمولاً به عنوان ژنوم مرجع برای گنجاندن در مجموعه داده‌ها استفاده می‌شود. با توجه به عدم دسترسی عمومی به کل توالی ژنوم نشان داده شده توسط کمپلکس کلونینگ آفریقایی ۱، و تعداد کم ژنوم از سویه‌های نماینده Af2 و Eu1، داده‌های توالی‌یابی اصلی ارائه شده توسط SRA در این موارد استفاده شد. کار زیمپل و همکارانش (۲۰۲۰) به شناسایی ژنوم از کمپلکس کلونینگ فوق‌الذکر کمک کرد و به انتخاب مایکوباکتریوم بوویس برای گنجاندن در مجموعه داده‌ها کمک کرد. برای Eu3، فقط یک نوع ژنوم شرح داده شده است (برانگر و همکاران، ۲۰۲۰)، بنابراین ژنومی که ما در نظر می‌گیریم، نماینده جداگانه‌ای از کمپلکس Eu3 است.
در سطح جهانی، این مجموعه داده‌ها شامل ۷۰ نمونه گاوی M. bovis جدا شده از ۸ گونه میزبان است که از سال ۱۹۸۵ تا ۲۰۱۶ در ۱۲ کشور توزیع شده‌اند. ۳۶ گونه به عنوان Eu2، ۷ گونه Eu1، ۱ گونه Eu3، ۳ گونه Af1، ۴ گونه Af2 تعیین شده‌اند و ۱۹ گونه به هیچ کمپلکس کلونال منتسب نیستند (جزئیات در زیر آمده است). اطلاعات دقیق (شامل شماره دسترسی) مایکوباکتریوم بوویس مورد استفاده در این مطالعه در جدول ۱ و جدول تکمیلی ۱ نشان داده شده است.
۴۲ ژنوم کامل مایکوباکتریوم بوویس که به تازگی از مناطق حساس به سل حیوانات پرتغال توالی‌یابی شده‌اند و بیش از ۱۲ سال است که توزیع شده‌اند، محور این مطالعه هستند، زیرا سیستم‌های بالقوه بیماری حیات وحش-دام به طور منظم تحت نظارت بوده‌اند ۳۱،۳۶ (شکل تکمیلی ۱). طبق رویه‌های بعدی، این سویه‌ها از سال ۲۰۰۳ تا ۲۰۱۵ از گاو (n = ۱۴)، گوزن قرمز (n = ۱۶) و گراز وحشی (n = ۱۲) جدا شدند: حیوانات را مطابق با دستورالعمل‌های پروتکل توصیه شده جمع‌آوری و حمل کنید. نمونه‌های بافتی در کتابچه راهنمای حیوانات زمینی OIE موجود است و روی محیط کشت جامد پیروات Stonebrink و Löwenstein-Jensen و محیط کشت مایع تلقیح می‌شوند. کشت‌ها در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه می‌شوند و رشد حداقل یک بار در هفته به مدت ۱۲ هفته بررسی می‌شود. کلنی‌ها مستقیماً در محلول گلیسرول در دمای ۸۰- درجه سانتیگراد نگهداری می‌شوند. در محیط کشت انتخابی مایکوباکتریوم (Middlebrook 7H9، BD Diagnostics)، نمونه‌های بایگانی‌شده اصلی از طریق یک پاساژ آزمایشگاهی (in vitro) عبور داده شدند تا DNA برنامه WGS به دست آید. برای این کار، محلول کشت منجمد با 5٪ پیروات سدیم و 10٪ ADS (50 گرم آلبومین، 20 گرم گلوکز، 8.5 گرم کلرید سدیم در 1 لیتر آب) در Middlebrook 7H9 در دمای 37 درجه سانتیگراد غنی شد. پس از 4 هفته رشد، محیط کشت تجدید شد و کشت به طور منظم تا زمان مشاهده رشد تحت نظر قرار گرفت. سلول‌ها با سانتریفیوژ برداشت شدند، رسوب در 500 میکرولیتر محلول نمکی بافر فسفات (PBS) دوباره به حالت تعلیق درآمد، به مدت 30 دقیقه در دمای 99 درجه سانتیگراد حرارت داده شد، سانتریفیوژ شد و محلول رویی تا زمان WGS در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد. همه مراحل در تأسیسات ایمنی زیستی سطح 3 انجام می‌شود.
کتابخانه ژنوم جفت‌شده WGS با استفاده از شاخص منحصر به فرد هر نمونه DNA تهیه می‌شود و از فناوری Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 نمونه) و HiSeq (2 × 150 pb) (دو ایزوله) (Eurofins Genomics، آلمان) برای تعیین توالی استفاده می‌کند. طبق دستورالعمل سازنده، از آنالیزور ژنوم Illumina با ماژول دو سر برای تعیین توالی DNA ژنومی استفاده کنید و از کیت آماده‌سازی کتابخانه DNA Nextera XT از Illumina برای ساخت کتابخانه استفاده کنید.
با در نظر گرفتن داده‌های بازیابی شده از SRA (n = 12)، شناسایی کمپلکس کلون می‌تواند به عنوان فراداده نشریه مربوطه 30، 41، 43 مورد استفاده قرار گیرد. هنگام بررسی ژنوم کامل، به جز Mycobacterium bovis AF2122/97 و Mycobacterium bovis 3601 که به ترتیب اعضای شناخته شده کمپلکس کلونال Eu1 و Eu3 25، 29 هستند، این ژنوم با ژنوم کامل Mycobacterium tuberculosis H37Rv (شماره دسترسی NCBI NC_000962.3) یکسان است. هم‌ترازی ژنوم با استفاده از MAFFT (برنامه هم‌ترازی چندگانه توالی اسید آمینه یا نوکلئوتید، نسخه 7.458) و پارامتر -addfragments48 انجام می‌شود. سپس، عدم وجود کمپلکس‌های کلونال مختلف و/یا وجود ویژگی‌های SNP را جستجو کنید.
توالی‌یابی جدید مایکوباکتریوم بوویس (n = 42) و خوانش‌های اولیه از پیش‌نویس ژنوم مونتاژ شده (n = 3)، کمپلکس را از طریق خط لوله vSNP و وجود ویژگی‌های حذف و/یا SNP کلون‌های مختلف، با ژنوم مرجع مایکوباکتریوم توبرکلوزیس H37Rv هم‌تراز می‌کنند. جستجو انجام شد.
اطلاعات مربوط به فقدان ویژگی‌ها و/یا وجود/عدم وجود SNP و پروفایل‌های اسپولیگوتایپینگ را جمع‌آوری کنید تا داده‌های ژنومی را به کمپلکس کلونال مربوطه اختصاص دهید. برای چهار مجموعه پیش‌نویس، پروفایل اسپولیگوتایپینگ قابل استنباط نیست، بنابراین آنها در گروه "بدون پیچیدگی" قرار می‌گیرند.
گردش کار بیوانفورماتیک که در این کار دنبال می‌شود، از مونتاژ و نگاشت de novo به یک استراتژی مرجع آغاز می‌شود، با هدف بررسی رویدادهای نوترکیبی و چندریختی‌های خاص ژنوم. شکل 1 نمودار جریانی از مراحل دنبال شده را نشان می‌دهد. برای تجزیه و تحلیل نوترکیبی، از همه ژنوم‌ها برای افزایش استحکام استنتاج‌ها و شاخص‌های مرتبط استفاده می‌شود.
به منظور کاهش خطاها در تولید توالی‌های اجماع ژنوم، ابتدا مونتاژ de novo و سپس هم‌ترازی‌های چندگانه هسته را به دست آوردیم. خط لوله Unicycler در حال حاضر در https://github.com/rrwick/Unicycler49 در دسترس است و برای انجام مونتاژ de novo 54 ژنوم توالی‌یابی شده (42 فایل توالی‌یابی شده جدید و 12 فایل fastq بازیابی شده از SRA) استفاده می‌شود. به طور خلاصه، قبل از مونتاژ از ابتدا، تجزیه و تحلیل کیفیت خواندن در FastQC نسخه 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC) و Trimmomatic نسخه 0.36 (گزینه "برش آداپتورها و سایر توالی‌های خاص نورپردازی از خواندن‌ها" و "برش پایه‌ها از انتهای خواندن، اگر کیفیت کمتر از آستانه 20 باشد" اعمال شود) (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50 انجام شد. سپس، از SPAdes optimiser49 برای مونتاژ ژنوم و از Pilon نسخه 1.1851 برای بهینه‌سازی پس از مونتاژ استفاده شد. یک حالت پل زدن محافظه‌کارانه برای جلوگیری از مونتاژ نادرست انتخاب شد و اندازه k-mer جستجو و بین 20 تا 95 درصد طول خواندن انتخاب شد. دستورالعمل‌های SPAdes را دنبال کنید و اندازه خوانش را در نظر بگیرید، کانتیگ‌های کوچک‌تر از ۳۰۰ جفت باز را حذف کنید و حد پوشش عمق خوانش ۲۰ را ۵۲ قرار دهید. در استراتژی مونتاژ de novo، نواحی ژنومی مانند پارالوگ‌های بسیار تکراری پرولین-گلوتامات (PE) و پرولین-پرولین گلوتامات (PPE) حذف نشدند.
کیفیت مونتاژ de novo از طریق خط لوله QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html) ارزیابی می‌شود، که نوسازی کانتیگ و نقشه‌برداری ژنوم مرجع M. bovis AF2122/97 (شماره دسترسی NCBI LT708304.1) را تسهیل می‌کند (برای پارامترهای کیفی به جدول تکمیلی 1 مراجعه کنید).
با کمک خط لوله vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP)، فایل FASTQ مربوط به M. bovis که به تازگی از توالی‌یابی Illumina توالی‌یابی شده است، با ژنوم مرجع M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) مقایسه می‌شود. طبق توصیه‌های بهترین شیوه جعبه ابزار تجزیه و تحلیل ژنوم (GATK) 53، 54، 55، پارامترهای فیلتر استاندارد یا نمرات جرمی متغیر را برای کالیبراسیون مجدد اعمال کنید. نتایج با استفاده از کمترین نمره جرمی SAMtools یعنی 150 و AC = 2 فیلتر می‌شوند. همچنین از Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) برای بررسی خوانش‌ها جهت رد آلودگی استفاده کنید. خط لوله vSNP که برای نگاشت به استراتژی‌های توالی‌یابی در کار ما استفاده می‌شود، مجموعه‌ای از SNPها و اهداف تعریف شده را بررسی می‌کند و همچنین سناریوهای عفونت مختلط را حذف می‌کند. پوشش ژنوم خوانده شده بهتر از 99٪ است (جدول تکمیلی 1).
برای جلوگیری از خطاهای نگاشت و SNP های اشتباه، یک واریانت را در موارد زیر فیلتر کنید: (1) با کمتر از 20 خوانش پشتیبانی می‌شود، (2) با فراوانی کمتر از 0.9 یافت می‌شود، (3) حداقل در یک سویه وجود دارد، اما حداقل در سویه دیگری شکاف وجود دارد. از نمایشگر ژنومیک یکپارچه (IGV) نسخه 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 برای تأیید بصری SNP ها و موقعیت ها با مشکلات نگاشت یا هم ترازی استفاده شد. از آنجایی که ژن های پرولین-گلوتامات (PE) و پرولین-پرولین گلوتامات (PPE) بسیار تکراری هستند و بخشی از یک خانواده چند ژنی هستند، به راحتی توسط توالی یابی و نگاشت نادرست Illumina اشتباه گرفته می‌شوند، بنابراین ترجیح داده می‌شوند. گردش کار بیوانفورماتیک مایکوباکتریایی هنگام استفاده از استراتژی نگاشت به توالی برای تأیید SNP ها، اعضای کمپلکس سل را حذف کرد. بنابراین، ما ژن های PE/PPE و ایندل ها را از تجزیه و تحلیل فیلتر کردیم.
طبق گفته‌ی Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/)، تمام SNPها به دسته‌های عملکردی تقسیم می‌شوند. از خط لوله‌ی SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) برای استنباط پیامدهای SNP (تغییرات مترادف یا غیر مترادف) استفاده می‌شود. یک پایگاه داده جدید از ژنوم Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1) ایجاد شد.
هم‌ترازی چندگانه ژنوم اصلی با استفاده از Parsnp نسخه ۱.۲، که در حال حاضر در آدرس https://github.com/marbl/parsnp57 موجود است، با استفاده از ۶۹ ژنوم/مجموعه پیش‌نویس کامل (با گزینه -c) انجام شد و M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) به عنوان مرجع استفاده شد. چهار هم‌ترازی چندگانه هسته انجام شد: فقط اعضای کمپلکس کلونینگ Eu2 (n = 37)، شامل تمام اعضای کمپلکس کلونینگ اروپایی (n = 44)، شامل نقطه اتصال کمپلکس کلونینگ اروپایی و آفریقایی (n = 51)، و شامل تمام مایکوباکتریوم بوویس در این مطالعه (n = 70).
هم‌ترازی هسته تولید شده توسط Parsnp برای استنباط درخت فیلوژنتیک حداکثر درستنمایی (ML) با استفاده از CIPRES Science Gateway نسخه 3.3 (http://www.phylo.org/)58 با استفاده از RAxML و انجام 1000 تکرار هدایت‌شده استفاده می‌شود.
سه الگوریتم و ابزار بیوانفورماتیک مختلف برای بررسی وجود رویدادهای نوترکیبی به صورت موازی استفاده می‌شوند: نرم‌افزار SplitsTree4، خط لوله Gubbins (دودمان بی‌طرفانه از طریق نوترکیبی در توالی‌های نوکلئوتیدی) و نرم‌افزار RDP4 (برنامه تشخیص نوترکیبی، نسخه بتا ۴.۱۰۱).
روش تجزیه تقسیم‌بندی که در SplitsTree4 نسخه 4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 پیاده‌سازی شده است، برای محاسبه شبکه فیلوژنتیک بدون ریشه، با استفاده از آزمون Phi برای تأیید آماری، استفاده می‌شود و آستانه معنی‌داری p = 0.05 است. تحلیل چند هم‌ترازی اصلی Parsnp به عنوان ورودی استفاده می‌شود و تجزیه تقسیم‌بندی به عنوان یک استاندارد شبکه محقق می‌شود.
خط لوله Gubbins نسخه ۲.۳.۱ (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) با پارامترهای پیش‌فرض اجرا می‌شود و راه دیگری برای ارزیابی تأثیر نوترکیبی بر روی Mycobacterium bovis است. الگوریتم پیاده‌سازی شده در خط لوله، دودمان کلون مربوطه را بازسازی می‌کند. مجموعه کامل ژنوم/پیش‌نویس مجموعه داده‌های ما و ژنوم مرجع (bovine bovid AF2122/97, LT708304.1) به صورت متقابل هستند؛ و موقعیت SNP را در هر شاخه از درخت اسکن می‌کنند تا خوشه SNP که نشان دهنده رویداد نوترکیبی است را شناسایی کنند. صفر شاخه فرض کنید که هیچ رویداد نوترکیبی وجود ندارد، به این معنی که SNPهایی که در شاخه رخ می‌دهند باید به طور مساوی توزیع شده باشند. هم‌ترازی چندگانه هسته از Parsnp و درخت ML با بهترین امتیاز از RAxML به عنوان فایل‌های ورودی استفاده می‌شوند.
در نهایت، به منظور تأیید رویداد سازماندهی مجدد پیشنهاد شده توسط خط لوله Gubbins، شش الگوریتم پیاده‌سازی شده در RDP467 (RDP61، GENECONV62، Bootscan63، Maxchi64، Chimaera65 و SiScan66) تحت تنظیمات پیش‌فرض بر روی هم‌ترازی چندگانه هسته Parsnp اعمال می‌شوند. ما مشخص کردیم که حداقل سه مورد از الگوریتم‌های پیاده‌سازی شده در RDP4 باید به طور مداوم یک سیگنال مهم را برای تأیید هر رویداد نوترکیبی نشان دهند.
با توجه به اینکه هر دو نرم‌افزار Gubbins و RDP با بررسی هم‌ترازی‌های چندگانه هسته در یک پنجره تا ۵۰۰ جفت باز، به دنبال سیگنال‌های نوترکیبی می‌گردند و تأیید می‌کنند که گنجاندن ژن‌های PE/PPE در طول مونتاژ de novo با سیگنال‌های نوترکیبی یافت‌شده تداخل نخواهد داشت، تجزیه و تحلیل بیشتر با استفاده از همخطی انجام می‌شود. مجاورت ژن شناسایی‌کننده رویداد نوترکیبی را بررسی کنید. نقشه سین‌لاینار با استفاده از ژنوم کامل با استفاده از هم‌ترازی چند ژنومی MAUVE (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) ساخته شد تا جابجایی‌ها یا وارونگی‌های ژنوم محلی حذف شوند. علاوه بر این، از کل ژنوم برای انجام تجزیه و تحلیل همخطی روی توالی اسید آمینه از طریق سرور وب SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) استفاده شد.
تجزیه و تحلیل عمیق‌تر مجموعه داده‌های ژنوم به‌دست‌آمده از سیستم سل چند میزبانه پرتغالی، بررسی چندشکلی ژن‌های ذکر شده در مقالات است. این ژن‌ها ۳۷،۳۸ و ژن کدکننده 3R هستند که توسط اجداد MTBC از طریق اجزای سیستم HGT (ترمیم، تکثیر و نوترکیبی DNA) ۳۹ به‌دست‌آمده است. از ClustalX نسخه ۲.۱ (http://www.clustal.org/clustal2/) و DnaSP نسخه ۶.۱۲.۰۳ (http://www.ub.edu/dnasp/) برای محاسبه تنوع ژنی و تنوع نوکلئوتیدی (π) و ورودی پارامتر آزمون خنثی D تاجیما استفاده کنید.
یک درخت فیلوژنتیکی با حداکثر احتمال (ML) بر اساس 69 جدایه مایکوپلاسما بوویس و ژنوم‌های مرجع به دست آمد (شکل 2A). در مقایسه با درخت‌های مبتنی بر تک ژن یا درخت‌های مبتنی بر چند جایگاه ژنی، این استراتژی امکان تولید درخت‌های قدرتمندتری را فراهم می‌کند که تنوع کل ژنوم را در بر نمی‌گیرند و بنابراین توانایی کمتری در تمایز بین گونه‌ها نشان می‌دهند (68،69). ساختار توپولوژیکی درخت ML معمولاً با طبقه‌بندی پیچیده کلون‌ها سازگار است. ژنوم Eu2 در یک شاخه خوشه‌بندی شده است و ژنوم Af1 نیز در کنار هم خوشه‌بندی شده است (شکل 2A). نتیجه همچنین با رابطه تکاملی شناخته شده مایکوباکتریوم بوویس سازگار است، یعنی تفاوت زیادی بین عضو Eu1 و گروهی که شامل تمام کمپلکس‌ها و ژنوم‌های کلونال دیگر است، وجود دارد، اما کمپلکس کلونال 30 مشخص نشده است. ناهماهنگی کوچک بین کمپلکس کلونال و رابطه مشاهده شده در درخت فیلوژنتیک را می‌توان با این واقعیت توضیح داد که کمپلکس کلونال بر اساس مناطق ژنومی خاص توصیف می‌شود، در حالی که درخت فیلوژنتیک بر اساس هم‌ترازی‌های چندگانه ژنوم‌های اصلی است که کل ژنوم را نشان می‌دهند.
درخت فیلوژنتیک حداکثر احتمال (GTR) بر اساس هم‌ترازی ژنوم اصلی ژنوم مایکوباکتریوم بوویس قبل (A) و بعد از (B) حذف جایگاه نوترکیبی ساخته شده است. رنگ‌های شاخه‌ها نشان‌دهنده کمپلکس کلون مایکوباکتریوم بوویس هستند: اروپا ۱ بنفش، اروپا ۲ قرمز، اروپا ۳ آبی، آفریقا ۱ نارنجی و آفریقا ۲ سبز است. درخت ریشه‌دار و بر اساس مقیاس رسم شده است و طول شاخه به عنوان جایگزینی برای هر جایگاه اندازه‌گیری می‌شود.
کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به عنوان یک گونه تکامل‌یافته کلونی توصیف می‌شود و بیشتر شواهد جمع‌آوری‌شده در طول سال‌ها از این ایده پشتیبانی می‌کند که رویدادهای HGT و نوترکیبی مداوم در سطح قابل تشخیص MTBC15،17،18 رخ نخواهند داد.
کارهای قبلی نشان داده‌اند که ممکن است نوترکیبی محدودی بین سویه‌های MTBC وجود داشته باشد20،21، در حالی که دیگران نتوانسته‌اند رویدادهای نوترکیبی قابل اندازه‌گیری را شناسایی کنند70،71. این موضوع را با تمرکز بر مایکوباکتریوم بوویس دوباره مورد بحث قرار دهید، که با کار قبلی که فقط مایکوباکتریوم توبرکلوزیس را در نظر می‌گرفت 70،71 متفاوت است؛ یا MTBC را به عنوان یک کل در نظر بگیرید، تقریباً هیچ M. bovis نماینده 20 نیست؛ یا فقط بخش‌های محدود گاو را در نظر بگیرید. در مجموعه داده‌های مایکوباکتریوم، در این کار، در مجموع 70 سویه وجود دارد که نماینده تمام کمپلکس‌های کلونال هستند و برای غربالگری نوترکیبی استفاده می‌شوند. مجموعه داده‌ها بر اساس چهار سطح تجمعی مقیاس‌بندی شده است: (1) اعضای Eu2، (2) تمام اعضای کمپلکس کلون اروپایی (یعنی اروپا)، (3) کمپلکس کلون اروپایی و آفریقایی (Eu + Af) و (4) کل مجموعه داده‌ها (از جمله ژنوم‌هایی که در هیچ کمپلکس کلونینگی که قبلاً شرح داده شده است، گنجانده نشده‌اند).
برای مطالعه بیشتر این فرضیه، یک شبکه تجزیه-تقسیم برای ارزیابی عدم وجود رویدادهای نوترکیبی بین ژنوم‌ها انجام شد، زیرا این روش می‌تواند رابطه اجدادی بین افراد را تجسم کند و سیگنال‌های فیلوژنتیکی متناقض را نمایش دهد. هر چهار مجموعه داده در تجزیه و تحلیل، وجود حلقه‌ها در شبکه را تأیید کردند (یعنی مناطقی که به یک درخت واحد همگرا نمی‌شوند)، اما آزمون Phi هیچ پشتیبانی آماری ندارد (Eu2، p = 0.0956؛ اروپا، p = 0.1637؛ Eu + Af p = 0.2774؛ کل مجموعه داده‌ها p = 0.2451)، که شواهد ضعیفی برای وجود رویدادهای سازماندهی مجدد ارائه می‌دهد (شکل 3A-D).
در اروپا ۲ ژنوم (n = ۳۷) (A)، ژنوم‌های اروپایی (n = ۴۴) (B)، ژنوم‌های اروپایی و آفریقایی (n = ۵۱) (C) و کل مجموعه داده‌ها (n = ۷۰) (D).
پس از این تجزیه و تحلیل، و با در نظر گرفتن مشاهدات چرخه‌ای در تمام شبکه‌ها، الگوریتم بازسازی پیاده‌سازی شده در خط لوله گابینز برای بازسازی دودمان کلونال و تکمیل تخمین اثر نوترکیبی بر ژنوم M. bovis اعمال شد. تعداد تجمعی رویدادهای نوترکیبی را که بیشتر آنها در شاخه‌های انتهایی (یعنی در یک ژنوم واحد) رخ داده‌اند، استنباط کنید (جدول 2). این شاخص‌ها، سازگاری کل مجموعه داده‌ها را نشان می‌دهند و نشان می‌دهند که فراوانی رویدادهای نوترکیبی 200 تا 300 برابر جهش‌ها است. هنگامی که پارامتر rho/theta که نشان دهنده نرخ نسبی نوترکیبی و جهش‌های نقطه‌ای در شاخه است، بین 0.0037 و 0.0056 به نظر می‌رسد (جدول 3). اخیراً، کار منتشر شده روی سویه ۳۸ M. bovis مقدار rho/theta بالاتری (rho/theta = 0.1) را نسبت به مقدار به‌دست‌آمده در این مجموعه داده‌ها نشان داد، اما کار پاتانه و همکارانش از مونتاژ مبتنی بر مرجع برای استنباط پارامترهای نوترکیبی استفاده کرد. جزئیات رویه‌ای، به دلیل رویه مونتاژ، با فراوانی رویدادهای نوترکیبی فرضی در شاخه انتهایی مرتبط بوده است.
در مرحله بعد، پارامتر r/m نشان دهنده نسبت تنوع نوترکیبی و معرفی جهش است و مقدار متوسط ​​آن بین 0.025 تا 0.037 است که نشان می‌دهد در مقایسه با جهش‌ها، نوترکیبی تأثیر کلی کمتری بر تنوع ژنتیکی M. bovis دارد (جدول 3). برای مقایسه گسترده، از روشی مشابه برای تخمین پارامتر r/m برای مجموعه داده‌های MTBC متشکل از 23 ژنوم استفاده شد که مقدار متوسط ​​0.48620 را نشان می‌دهد، در حالی که برای مجموعه داده‌های 38 M. bovis پاتانه و همکارانش، مقدار متوسط ​​0.98 است. در مطالعه اول، تنها دو مورد از 23 ژنوم موجود در کار M. bovis (M. bovis BCG و سویه مرجع) وجود داشت، بنابراین مقدار به دست آمده ممکن است به دلیل بیان بیش از حد ژنوم M. tuberculosis دارای سوگیری باشد. در گزارش دوم، جمعیت‌های مایکوباکتریوم بوویس مورد تجزیه و تحلیل عمدتاً از ایالات متحده و میزبان‌های دامی بازیابی شدند. در مقابل، در مجموعه داده‌های ما، مکان‌های جغرافیایی و گونه‌های میزبان بیشتری نشان داده شده است و ژنوم‌های گروه‌بندی شده در کمپلکس‌های کلونال مختلف با ویژگی‌های ژنتیکی جمعیتی متفاوت نیز استفاده می‌شوند، بنابراین به دانش جمعیتی عمیق‌تر و گسترده‌تری دست می‌یابند. مقدار میانگین r/m اختلاف به‌دست‌آمده با مجموعه داده‌های ما با این مفهوم سازگار است که درجه نوترکیبی بین دودمان‌های اختصاص داده شده به گونه‌های طبقه‌بندی یکسان بسیار متفاوت است، بنابراین این نتایج نشان می‌دهد که کمپلکس کلون M. bovis ممکن است تفاوت‌های نوترکیبی را نشان دهد. این تأثیر همچنین توسط Didelot & Maiden72 پیشنهاد شده است. با این وجود، گسترش قابل توجه این مجموعه داده‌ها با گنجاندن تعداد بیشتری از ژنوم‌های M. bovis امکان روشن شدن بیشتر این نکته را فراهم می‌کند. هر دو پارامتر r/m و rho/theta تنوع بین شاخه‌ها را نشان می‌دهند و این نتیجه با گزارش‌های مربوط به سایر گونه‌های باکتریایی سازگار است.72،73
در نهایت، به منظور تأیید رویدادهای سازماندهی مجدد شناسایی شده توسط خط لوله گابینز، شش الگوریتم مختلف در نرم‌افزار RDP4 برای آزمایش مستقل مقایسه‌های چندگانه اصلی مختلف استفاده شد. در سطح جهانی، کمتر از نیمی از رویدادهای شناسایی شده توسط گابینز توسط RDP4 تأیید شدند (جداول 4 و 5). با توجه به کل مجموعه داده‌ها، سه رویداد نوترکیبی تأیید شد، دو مورد شامل گره‌های داخلی و دیگری شامل یک ژنوم واحد در یک شاخه انتهایی، که برای آن کمپلکس‌های کلونال قابل تعیین نبودند (جداول 4 و 5). شناسایی رویدادها در شاخه‌های انتهایی ممکن است نشان دهد که نوترکیبی هنوز در سویه‌های معاصر M. bovis در حال انجام است یا نتیجه نادرست است70. در این ناحیه نوترکیبی فرضی، تقریباً 20٪ از موقعیت‌ها دارای نوکلئوتیدهای تعریف نشده (N) هستند، بنابراین بر سیگنال نوترکیبی تأثیر می‌گذارند (شکل تکمیلی 2). علاوه بر این، این ناحیه بر ژن rrs تأثیر می‌گذارد و RNA ریبوزومی 16S را رمزگذاری می‌کند که انتظار می‌رود بسیار حفاظت‌شده باشد، بنابراین این سیگنال نوترکیبی فرضی ممکن است نتیجه خطاهای توالی‌یابی یا ناهم‌ترازی باشد. سپس هم‌ترازی کل ژنوم بین Mb0003 و Mycobacterium bovis AF2122/97 انجام شد و وجود نوکلئوتیدهای تعریف نشده و SNPها تأیید شد، بنابراین مشکلات احتمالی مربوط به هم‌ترازی اشتباه به دلیل اطلاعات بیولوژیکی پیاده‌سازی شده در این کار نبود و پس از یادگیری برنامه ظاهر شد.
هیچ شکاف یا نوکلئوتید نامشخصی در نواحی نوترکیبی گره‌های داخلی یافت نشد (شکل‌های ۴ و ۵). با توجه به این رویدادها، یکی فقط شامل ژنوم Eu2 است و بر ژن pks12 تأثیر می‌گذارد که یک پلی‌کتید سنتاز احتمالی را رمزگذاری می‌کند؛ در حالی که دیگری در ژنوم Eu1 ثبت شده است و بر ژن narX که یک نیترات ردوکتاز احتمالی را رمزگذاری می‌کند، تأثیر می‌گذارد (جدول ۴). به طور کلی، تجزیه و تحلیل نوترکیبی نشان می‌دهد که تعداد محدودی از قطعات نوترکیبی با پشتیبانی آماری وجود دارد و شاخص‌های استنباط شده نشان می‌دهند که نوترکیبی تأثیر کمی بر دودمان M. bovis دارد. انتظار می‌رود سیگنال نوترکیبی کم باشد، اما تشخیص سیگنال تکامل واقعی از نویز پس‌زمینه مهم است که یک کار چالش برانگیز است. به منظور کاهش سیگنال نویز ناشی از مونتاژ مبتنی بر مرجع و مشکلات عدم تطابق 70، 71، بقیه موارد به جز ژنوم کامل از ابتدا مونتاژ شدند و کیفیت مونتاژ با تجزیه و تحلیل خط لوله QUAST بررسی و تضمین شد (جدول تکمیلی 1). علاوه بر این، یک سری تجزیه و تحلیل تکمیلی برای ارائه استحکام و دقت بررسی کلی انجام شد. بنابراین، کیفیت توالی‌یابی ژن‌های narX و pks12 با نقشه‌برداری خوانش در برابر Mycobacterium bovis AF2122/97 ارزیابی شد. موقعیت SNP توصیه شده در ناحیه نوترکیبی با اعمال معیارهای ذکر شده در بخش روش (حداقل 20 خوانش و فرکانس تغییر 0.9) تأیید شد. چندشکلی ژن narX در دو ژنوم (Mb1792361 و Mb7240415؛ 2.3%) و ژنوم‌های ژنوم pks12: ژن‌های Mb0891، Mb1711، Mb1789، Mb1870، Mb17046، Mb1756 و Mb12 کاملاً تأیید شد. با این حال، برای ژنوم Mb2043، شش مورد از هشت موقعیت، معیار عمق خواندن را برآورده نمی‌کنند زیرا SNP با حداکثر 17 خواندن پشتیبانی می‌شود که کمتر از مقدار حد مجاز تعیین شده 20 است. بنابراین، نوترکیبی شش ژنوم (8.6%) در این محل ژنوم قابل تأیید است (شکل‌های 4 و 5).
تجسم دقیق هم‌ترازی ناحیه نوترکیبی مجموعه داده‌های مایکوباکتریوم بوویس، ژن narX را که یک نیترات ردوکتاز احتمالی را کد می‌کند، تحت تأثیر قرار می‌دهد. هیچ شکاف یا نوکلئوتید نامشخصی در ناحیه نوترکیبی گره‌های داخلی یافت نشد. این رویداد خاص در ژنوم Eu1 ثبت شده است. کیفیت توالی‌یابی ژن narX با ترسیم خوانش‌های مایکوباکتریوم بوویس AF2122/97 ارزیابی شد. با اعمال معیارهای ذکر شده در بخش روش (حداقل 20 خوانش و فرکانس تغییر 0.9)، محل SNP توصیه شده در ناحیه نوترکیبی را تأیید کنید. پلی‌مورفیسم ژن narX در ژنوم‌های Mb1792361 و Mb7240415 (2.3٪) به طور کامل تأیید شد.
تجسم دقیق ترازبندی ناحیه نوترکیبی مجموعه داده‌های مایکوپلاسما بوویس که بر ژن pks12 تأثیر می‌گذارد. هیچ شکاف یا نوکلئوتید نامشخصی در ناحیه نوترکیبی گره‌های داخلی یافت نشد. در مورد رویدادی که بر ژن pks12 که کدکننده پلی‌کتید سنتاز احتمالی است، تأثیر می‌گذارد، فقط شامل ژنوم Eu2 است. کیفیت توالی‌یابی pks12 با نقشه‌برداری خوانش مایکوباکتریوم بوویس AF2122/97 ارزیابی شد. با اعمال معیارهای ذکر شده در بخش روش (حداقل 20 خوانش و فرکانس تغییر 0.9)، مکان SNP توصیه شده در ناحیه نوترکیبی را تأیید کنید. پلی‌مورفیسم‌های ژنوم‌های Mb0891، Mb1711، Mb1789، Mb1870، Mb1758، Mb2043 و Mb1960 به طور کامل تأیید شده‌اند.
ژن‌های PE و PPE دارای نواحی تکراری هستند که به راحتی توسط توالی‌یابی و نگاشت نادرست Illumina اشتباه خوانده می‌شوند، بنابراین معمولاً فقط هنگام استفاده از استراتژی نگاشت به توالی، از گردش کار بیوانفورماتیک اعضای M. tuberculosis حذف می‌شوند. استنتاج رویدادهای نوترکیبی که در این کار اعمال می‌شود، مبتنی بر مونتاژ de novo بدون فیلتر کردن PE/PPE است. ما معتقدیم که با پیاده‌سازی سه روش و الگوریتم مکمل مختلف از طریق SplitsTree، Gubbins pipeline و نرم‌افزار RDP4، استراتژی‌های اعمال شده در برابر پردازش و فیلتر کردن نواحی سازماندهی مجدد شده ناشی از سیگنال‌های خطا مقاوم هستند. با این حال، به منظور حذف تداخل ژن PE/PPE در نرم‌افزار Gubbins و RDP4 برای شناسایی خوشه‌های SNP و در نتیجه شناسایی نواحی نوترکیبی که برای تأثیرگذاری بر ژن‌های narX و pks12 پیشنهاد شده‌اند، همسایگی این ژن‌ها بررسی شد (شکل تکمیلی 3-5). در M. bovis AF2122/97، ژن narX توسط narK2 و Mb1764c از هم جدا شده است، در حالی که pks12 توسط Mb2075c و Mb2073c احاطه شده است (شکل تکمیلی 3-5). نقشه تولید شده با استفاده از نقشه سینلاین MAUVE از ژنوم کامل، اطلاعاتی در مورد حفاظت و بازآرایی توالی ژن ارائه می‌دهد که چهار بلوک هم‌خطی را نشان می‌دهد و هیچ نشانه‌ای از جابجایی یا وارونگی ژنوم وجود ندارد. علاوه بر این، تجزیه و تحلیل مکمل‌سازی با توالی اسید آمینه، همولوژی را در تمام ژنوم‌های کامل اثبات کرد و هیچ PE/PPE در مناطق مجاور narX یا pks12 یافت نشد. برای narX، یک ژنوم (Mb0030) امتیاز مترادف کمتری دارد زیرا ژن narX به صورت دو قطعه (قطعات 1891 و 1890) شناسایی شد. برای pks12، به دلیل شباهت‌ها، Mb0030 و Mb003 امتیاز هم‌خطی کمتری نشان دادند، در حالی که pks12 به ترتیب در دو و سه قطعه شناسایی شد که نشان‌دهنده دامنه‌های مختلف پروتئین هستند (شکل تکمیلی 3-5). با در نظر گرفتن این اطلاعات، و با توجه به اینکه نرم‌افزارهای Gubbins و RDP4 هر دو تجزیه و تحلیل را انجام می‌دهند، بررسی هم‌ترازی چندگانه هسته حداکثر 500 جفت باز در پنجره، تأیید کردیم که ژن PE/PPE با سیگنال نوترکیبی که بر narX و pks12 تأثیر می‌گذارد، تداخل نخواهد داشت.
اگرچه سیگنال‌های نوترکیبی شناسایی‌شده در این مجموعه داده‌ها ممکن است باقیمانده در نظر گرفته شوند، اما درست است که نوترکیبی در M. bovis را نمی‌توان رد کرد، بنابراین باید همچنان موضوع تجزیه و تحلیل بیشتر باشد، که در آن کل ژنوم‌ها از سناریوهای مختلف اپیدمیولوژیک به ترتیب توالی‌یابی می‌شوند.
مقایسه درخت‌های فیلوژنتیک ML به‌دست‌آمده قبل و بعد از اصلاح نوترکیبی (شکل 2A، B) منجر به تغییرات قابل‌توجهی در رابطه فیلوژنتیکی استنباط‌شده نشد و سویه‌های M. bovis در یک گروه قرار گرفتند.
پس از نقشه‌برداری ۴۲ توالی جدید M. bovis با ژنوم مرجع M. bovis AF2122/97، یک هم‌ترازی SNP حاوی ۱۸۱۶ موقعیت چندشکلی به دست آمد. اکثر SNPها (۸۷.۱٪) در ناحیه کدکننده قرار دارند و ژن‌های تحت تأثیر طبق دسته‌های عملکردی نشان داده شده در Bovilist (شکل ۶A، B) مشخص می‌شوند. با در نظر گرفتن تعداد کل ژن‌ها در هر دسته عملکردی، ژن‌های دسته "متابولیسم لیپید" SNPهای بیشتری را نشان دادند و پس از آن "دیواره سلولی و فرآیندهای سلولی" و "متابولیسم و ​​تنفس میانی" قرار گرفتند که نشان می‌دهد آنها در تکامل M. bovis قرار دارند.
تحلیل سلسله مراتبی مجموعه داده‌های M. bovis از پرتغال (n = 42). تعداد کل SNPهای ثبت شده و ژن‌های تحت تأثیر برای هر دسته عملکردی (A). تعداد کل تغییرات مترادف و غیرمترادف ثبت شده بر اساس دسته عملکردی (B).
در مقیاس جهانی، میانگین نسبت dN/dS بهتر از ۱.۵ است، که نشان می‌دهد فشار تکاملی جهانی برای خلاص شدن از حالت اجدادی است و نشان‌دهنده یک سناریوی انتخاب خالص‌سازی مثبت (متنوع یا هدایت‌شده) و/یا آسان‌گیرانه است. در دسته‌های «بیماری‌زایی، سم‌زدایی، سازگاری»، «توالی‌های الحاقی و فاژها» و «پروتئین‌های تنظیمی»، بیش از دو سوم SNPها غیرمترادف هستند (شکل ۶B).
در همه دسته‌ها، ژن‌هایی با چندین SNP وجود دارند که منجر به میانگین نرخ جهش (یعنی میانگین SNP در هر ژن) بیشتر از 1 می‌شود (شکل 6A). Pks12 (Mb2074c) با 15 SNP و fas (Mb2553c) با 8 SNP مقادیر جهش بالاتری دارند. هر دوی این ژن‌ها در متابولیسم اسیدهای چرب نقش دارند. ژن pks، پلی‌کتید سنتاز (PKS) را کد می‌کند که یک آنزیم چند منظوره است که در بیوسنتز لیپید دیواره سلولی مایکوباکتری‌ها نقش دارد74،75. این ژن یک پلی‌پپتید چند منظوره را کد می‌کند که در سنتز مایکوکتیدها74،76 نقش دارد. ژن fas در سنتز اسید مایکولیک نقش دارد. هر دوی این ژن‌ها نقش مهمی در بیوسنتز دیواره سلولی در تماس با میزبان دارند.
به منظور مطالعه بیشتر تکامل مایکوباکتریوم بوویس، دو مجموعه از ژن‌های خاص مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. آثار منتشر شده قبلی با استفاده از ترکیب توالی و روش‌های فیلوژنتیک، ژن‌هایی را شناسایی کردند که توسط اجداد MTBC از طریق HGT قبل از تنوع به دست آمده‌اند37،38. این ژن‌ها در جدول تکمیلی 2 فهرست شده‌اند. توزیع SNP در مجموع 77 ژن که ممکن است مربوط به HGT باشند، تجزیه و تحلیل شد و 26 جایگاه چندشکلی شناسایی شد که در بیشتر موارد (78٪) منجر به تغییرات غیر مترادف (NS) شد (جدول تکمیلی 2). کارهای قبلی روی ژنوم MTBC نشان داد که ناحیه HGT فرضی، نسبت SNP NS بالاتری را در مقایسه با بقیه ژنوم نشان می‌دهد. اگر کسی فکر کند که این مناطق نوترکیبی توسط اجداد MTBC به دست آمده‌اند و بنابراین، آنها بیش از حد پلی‌مورفیسم‌های باستانی را نشان می‌دهند، انتظار می‌رود نسبت تغییرات مترادف بیشتر باشد، زیرا انتظار می‌رود جایگزینی‌های NS به دلیل تغییرات اسید آمینه با انتخاب منفی حذف شوند. ممکن است عملکرد پروتئین را تغییر دهند. بنابراین، نتایج ما نشان می‌دهد که پیامدهای عملکردی ممکن است ناشی از جایگزینی ژن‌های شبه HGT باشد، که نشان‌دهنده اهمیت آنها برای تنوع ژنتیکی تطبیقی ​​ارزشمند است.
به موازات این تجزیه و تحلیل، ژن‌های کدکننده اجزای سیستم 3R (ترمیم، همانندسازی و نوترکیبی DNA) مطابق با فهرستی که قبلاً توسط دوس ولتوس و همکارانش (2008)39 منتشر شده بود، به طور کامل بررسی شدند. تبادل قطعات DNA یکسان را نمی‌توان مستقیماً مشاهده کرد، اگرچه ممکن است زمانی که باکتری‌های نزدیک به هم درگیر هستند، مانند مورد این مجموعه داده‌ها، یک فرآیند مکرر باشد. علاوه بر این، این فرآیند ممکن است کلید روش‌های ترمیم DNA باشد72، بنابراین نقشی در نوترکیبی همولوگ ایفا می‌کند. در مجموع 26 موقعیت چندشکلی توزیع شده توسط 54 ژن شناسایی شد (جدول تکمیلی 3). در این مجموعه از ژن‌ها، تغییرات NS حدود 65٪ از پیامدها را تشکیل می‌دهند که با گزارش‌های قبلی در مورد سویه‌های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس مطابقت دارد.