Grazzi talli żort Nature. Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għas-CSS. Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża verżjoni aktar ġdida tal-browser (jew titfi l-modalità ta' kompatibilità fl-Internet Explorer). Fl-istess ħin, biex niżguraw appoġġ kontinwu, se nuru siti mingħajr stili u JavaScript.
Is-sekwenzar tal-ġenoma ta ħajja ġdida lill-qasam tar-riċerka dwar il-mard infettiv, billi żvela l-epidemjoloġija tal-mard, il-patoġenesi, l-interazzjonijiet bejn l-ospitant u l-patoġenu, u l-proċess evoluzzjonarju impost fuq il-patoġeni. Il-kumpless Mycobacterium tuberculosis (MTBC) iqis il-Mycobacterium bovis bħala wieħed mill-membri adattivi tal-annimali tiegħu li jikkawżaw it-tuberkulożi (TB) fil-mammiferi terrestri, u huwa mudell tipiku ta' evoluzzjoni batterjali. Bħal membri oħra tal-MTBC, il-Mycobacterium bovis huwa preżunt li huwa patoġenu strettament ikklonat, li jevolvi bil-mod, u ovvjament m'hemm l-ebda sinjal ta' rikombinazzjoni jew trasferiment orizzontali tal-ġeni. F'dan ix-xogħol, napplikaw ġenomika komparattiva għal sett ta' dejta ta' sekwenza tal-ġenoma sħiħa (WGS) magħmul minn 70 M. tal-baqar minn pedigrees differenti (l-Ewropa u l-Afrika) biex niksbu għarfien dwar id-diversità ġenetika tal-M. tal-baqar. Qawwa evoluzzjonarja. Tliet metodi differenti jintużaw biex jiġu stmati s-sinjali ta' riorganizzazzjoni. Globalment, numru żgħir ta' avvenimenti ta' rikombinazzjoni ġew identifikati u kkonfermati minn żewġ metodi indipendenti b'appoġġ sod. Madankollu, meta mqabbla mal-mutazzjonijiet, ir-rikombinazzjoni għandha effett aktar dgħajjef fuq id-diversità ta' M. bovis (r/m ġenerali = 0.037). Id-differenza medja r/m miksuba fil-kumpless klonali ta' Mycobacterium bovis fis-sett tad-dejta tagħna hija konsistenti mal-kunċett ġenerali li l-grad ta' rikombinazzjoni jista' jvarja ħafna bejn il-linji assenjati lill-istess speċi tassonomiċi. Abbażi ta' dan ix-xogħol, ir-rikombinazzjoni f'Mycobacterium bovis ma tistax tiġi eskluża, għalhekk għandha tkun is-suġġett ta' aktar sforzi fir-riċerka ġenomika komparattiva futura, fejn il-WGS ta' settijiet ta' dejta kbar minn xenarji epidemjoloġiċi differenti madwar id-dinja hija kruċjali. Imbagħad twettqet analiżi addizzjonali fuq is-sett ta' dejta iżgħar ta' Mycobacterium bovis (n = 42) mill-prevalenza tat-TB b'ħafna ospiti, u ġew identifikati aktar minn 1,800 loci, li minnhom mill-inqas razza waħda wriet polimorfiżmu ta' nukleotide wieħed (SNP). Il-biċċa l-kbira (87.1%) jinsabu fir-reġjun tal-kodifikazzjoni, u l-proporzjon globali ta' bidliet mhux sinonimi (dN/dS) ta' bidliet sinonimi jaqbeż il-1.5, u dan jindika li l-għażla pożittiva hija forza evoluzzjonarja importanti eżerċitata fuq M. bovis. Proporzjon ogħla ta' SNPs instabu f'ġeni rikki f'kategoriji funzjonali ta' "metaboliżmu tal-lipidi", "proċessi tal-ħajt taċ-ċellula u ċellulari", u "metaboliżmu u respirazzjoni intermedji", u dan juri l-potenzjal tagħhom fil-bijoloġija u l-evoluzzjoni tal-importanza ta' Mycobacterium bovis. Ħarsa aktar mill-qrib lejn il-ġeni fl-antenati MTBC li huma suxxettibbli għal trasferiment orizzontali tal-ġeni u inklużi fis-sistema 3R (tiswija tad-DNA, replikazzjoni, u rikombinazzjoni) turi l-valur negattiv medju globali tat-test newtrali D ta' Taijima, li jindika skannjar selettiv tal-passat. L-ostaklu reċenti wara l-espansjoni tal-popolazzjoni għadu l-fattur ewlieni li jmexxi l-evoluzzjoni għall-patoġenu obbligatorju Mycobacterium bovis biex jiġġieled kontra l-ospitant.
Il-kumpless Mycobacterium tuberculosis (MTBC) huwa wieħed mit-taxa l-aktar ta' suċċess ta' patoġeni batteriċi u każ tipiku ta' evoluzzjoni batterika. Il-membri tiegħu juru identità ta' nukleotidi sorprendentament għolja fil-livell ġenomiku (> 99%)1,2. Ekotipi differenti ta' MTBC jistgħu jikkawżaw it-tuberkulożi (TB), li hija marda granulomatoża infettiva, f'firxa wiesgħa ta' speċi ospitanti minn mikro-mammiferi sal-bnedmin3,4,5. Bħalissa, il-kumpless jinkludi bnedmin [M. Tuberculosis (Mtb), Mycobacterium africanum] u patoġeni adattati għall-annimali (Mycobacterium bovis, Mycobacterium capitum, Mycobacterium pinnipedum, Mycobacterium microtobacter, Mycobacterium mongee, Mycobacterium miysani, Mycobacterium surika, "Bacillus chimpanzee" u "dassie") 5,6. M. canettii (magħruf ukoll bħala "Nodobacter glabrata") L-identità medja tan-nukleotidi mal-mikobatterji msemmija hawn fuq hija ta' 98%, u xogħol ġenomika komparattiva wera li M. canettii u l-bqija tal-MTBC dan l-aħħar iddiverġew mill-antenat komuni.7 Meta wieħed iqis dan il-kunċett, xi awturi jsejħu lil M. canettii Membru tal-MTBC 8.
L-MTBC huwa deskritt sistematikament bħala kumpless klonali strett, u l-istruttura tal-popolazzjoni tiegħu hija rregolata b'mod ċar minn diversità mnaqqsa, konġestjonijiet, skennjar selettiv, u drift ġenetiku9,10. Jekk nassumu li evoluzzjoni klonali stretta kumplessa, bħal polimorfiżmi neqsin, ma tistax tiġi restawrata permezz ta' rikombinazzjoni. Abbażi ta' din il-premessa, l-avvenimenti konsekuttivi tat-tħassir ġenomiku tar-reġjun differenzjali (RD) u TbD1 (reġjun 1 ta' tħassir speċifiku għall-Mtb) ġew proposti bħala markaturi molekulari tal-evoluzzjoni tal-MTBC2,5,11. Ix-xogħol ġenomiku komparattiv u s-sekwenzar tal-ġenoma sħiħ (WGS) jappoġġja d-diviżjoni tal-membri adattati għall-bniedem f'disa' linji (Mycobacterium tuberculosis L1 sa L4, L7, u L8; u Mycobacterium africanum L5, L6, u L9), il-linji L2 sa L4 qasmu t-tħassir tar-reġjun TbD12,11,12,13. Barra minn hekk, huwa propost li membri adattati għall-annimali jaqsmu antenat komuni, li huwa definit minn tħassir speċifiku għall-klade f'RD7, RD8, RD9 u RD102, 5, u 14.
It-trasferiment orizzontali tal-ġeni (HGT) u l-avvenimenti ta' rikombinazzjoni huma kkunsidrati rari u jseħħu fl-antenati tal-MTBC, aktar milli fl-istorja differenti tal-membru kollu tal-MTBC15,16,17. Żewġ rapporti bikrija minn Hughes u l-kollaboraturi (2002) u Gutacker u l-kollaboraturi (2006) issuġġerew li l-avvenimenti ta' rikombinazzjoni jistgħu jgħinu biex jiffurmaw polimorfiżmi li jimmarkaw loci speċifiċi fir-razez ta' M. tuberculosis18,19. Ir-raġunijiet għan-nuqqas ovvju ta' rikombinazzjoni fl-MTBC huma: (1) il-proċess mekkaniku u t-telf tal-abbiltà tal-HGT; (2) ir-rarità tal-avvenimenti tal-HGT; (3) m'hemm l-ebda ċans ta' avvenimenti ta' rikombinazzjoni fin-niċċa tal-MTBC14,17. Riċentement, xi studji ta' sekwenzar tal-ġenoma sħiħ (WGS) applikati għar-razza 20 tal-MTBC u l-Mycobacterium bovis 21 ipprovdew evidenza ta' rikombinazzjoni, l-ewwel li wrew li r-razez tal-MTBC spiss jiskambjaw frammenti żgħar tad-DNA, iżda minħabba varjazzjoni limitata fis-sekwenza tan-nukleotidi, dawn l-avvenimenti xorta ma jiġux innutati.
Mycobacterium bovis huwa l-aktar membru tal-MTBC li jinstab komunement mill-bhejjem (l-aktar baqar), għalkemm jista' jiġi iżolat ukoll minn annimali selvaġġi li jgħixu fil-beraħ u mdawra b'ċnut4,22,23,24. M. bovis evolva f'ħames kumplessi klonali ewlenin [European 1 (Eu1), European 2 (Eu2), European 3 (Eu3), African 1 (Af1) u Africa 2 (Af2)], skont il-profil tal-ispoligotipazzjoni, tħassir speċifiku u polimorfiżmi ta' nukleotidi singoli (SNPs) 25, 26, 27, 28, 29 f'ġeni speċifiċi. Dawn il-kumplessi klonali juru l-istruttura diversa tal-popolazzjoni ta' Mycobacterium bovis u l-assoċjazzjoni tagħha mar-reġjuni ġeografiċi. Barra minn hekk, ix-xogħol reċenti tal-WGS imwettaq minn Zimpel u l-kollaboraturi tiegħu (2020) iddisinja filogenija bbażata fuq l-SNP ta' Mycobacterium bovis, b'aktar minn 1,900 ġenoma, li jindika li hemm mill-inqas erba' linji differenti (imsejħa Lb1 sa Lb1 sa Lb4), li mhumiex kompletament konsistenti mal-kumpless klonali definit qabel, għalkemm l-ispeċifiċità ġeografika tista' tiġi kkonfermata wkoll30. Dawn l-awturi wettqu analiżi differenzjali tal-filogenija u d-datazzjoni molekulari, iżda ma studjawx ir-rikombinazzjoni30.
Xogħol preċedenti bl-użu ta' tekniki molekulari differenti, bħal spoligotyping, MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repeat unit-variable tandem repeat number), u t-tajping SNP reċenti żvela ċertu livell ta' diversità ġenetika fost ir-razez ta' M. bovis 31,32,33, 34,35. Id-differenzjazzjoni tal-varjazzjoni ġenetika saret għodda importanti fl-istudju tal-epidemjoloġija tal-mard, li hija utli għal fehim fil-fond tal-patoġenesi, il-virulenza u t-trażmissjoni tal-mard. Il-feġġ tal-metodu WGS jipprovdi l-possibbiltà li jiġu żvelati l-fatturi evoluzzjonarji li jmexxu l-ġenoma ta' Mycobacterium bovis fil-proċess ta' adattament u persistenza għal ospiti u xenarji epidemjoloġiċi differenti.
F'dan ix-xogħol, nużaw analiżi ġenomika komparattiva fuq diversi settijiet ta' dejta ta' Mycoplasma bovis (n=70), inklużi iżolati minn kumplessi klonali differenti, biex niksbu għarfien dwar il-proċess evoluzzjonarju ta' Mycoplasma bovis, speċjalment biex insolvu r-relazzjonijiet filogenetiċi u l-avvenimenti ta' rikombinazzjoni. Bħala suppliment għal din l-analiżi, ġie esplorat aktar sett ta' sottodejta ta' iżolati ta' M. bovis (n = 42) miksuba minn żona ta' tuberkulożi b'ħafna ospiti kkaratterizzata sew fil-Portugall 31,36 biex jiġi inferit in-non-identità. Il-bilanċ bejn il-proporzjon relattiv ta' sostituzzjonijiet ta' nukleotidi sens (dN) għal sinonimi (dS), kif ukoll il-kontribut evoluzzjonarju ta' ġenomi speċifiċi msemmija fil-letteratura, huma 37,38 miksuba minn antenati MTBC permezz ta' HGT, u jikkodifikaw komponenti tal-ġeni tas-sistema 3R (tiswija tad-DNA, replikazzjoni, u rikombinazzjoni) 39. Agħżel ġeni miksuba permezz ta' HGT għaliex jistgħu jirrappreżentaw polimorfiżmi antiki, għalhekk huwa mistenni li jistgħu jkun fihom proporzjon ogħla ta' bidliet sinonimi. Il-ġeni inklużi fis-sistema 3R intgħażlu għaliex xogħol preċedenti fuq razez ta' M. tuberculosis indika selezzjonijiet ġenerali negattivi/ta' purifikazzjoni li jaħdmu fuq dawn il-ġeni, u jistgħu jkollhom rwol importanti fl-evoluzzjoni 39. Għan ieħor ta' dan ix-xogħol huwa li tiġi dedotta l-eżistenza ta' avvenimenti ta' riorganizzazzjoni. Għal din ir-raġuni, meta wieħed iqis li s-sett tad-dejta tagħna mill-Portugall fih biss il-ġenomi tal-kumpless tal-kloni Ewropej 2 u r-razez li ma assenjawx il-kumpless tal-kloni, iddeċidejna li ninkludu dejta tal-ġenoma disponibbli pubblikament biex finalment niksbu rappreżentant tal-kumplessi tal-kloni kollha, u ntejbu r-robustezza u l-wisa' tar-riżultati.
42 ġenoma ta' Mycoplasma bovis sekwenzati ġodda mix-xena endemika Portugiża tat-tuberkulożi b'ħafna ospiti (dettalji hawn taħt), li qabel kienu kkaratterizzati minn perspettiva epidemjoloġika36, huma ċ-ċentru ta' dan ix-xogħol. Meta wieħed iqis li s-sett ta' dejta mill-Portugall għandu biss rappreżentanti tal-kumplessi Ewropej ta' 2 kloni u razez mingħajr kumplessi ddeżinjati, ġiet miżjuda dejta ta' sekwenzjar tal-ġenoma sħiħ disponibbli pubblikament biex tespandi s-sett ta' dejta li jinkludi r-rappreżentanti kollha tal-kumplessi tal-kloni ta' M. bovis. Għalhekk, f'dan ix-xogħol intużaw tliet sorsi ta' dejta ta' sekwenzjar tal-ġenoma sħiħ: assemblaġġ tal-ġenoma komplut/abbozzat, sa 10 scaffolds maħżuna fl-NCBI (Ċentru Nazzjonali għall-Informazzjoni dwar il-Bijoteknoloġija) (n = 15-il iżolat); maħżuna fl-SRA (Il-fajl Illumina fastq tal-arkivju tal-qari tas-sekwenza) jirrappreżenta d-diversità kumplessa tal-kloni ta' M. bovis (n = 12-il iżolat)30; u 42 ġenoma sekwenzati ġodda mill-Portugall. Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guerin) ġie eskluż mit-tfittxija tal-NCBI. M. bovis AF2122/97 ġeneralment jintuża bħala ġenoma ta' referenza biex jiġi inkluż fid-dataset. Minħabba n-nuqqas ta' disponibbiltà pubblika tas-sekwenza tal-ġenoma sħiħa rappreżentata mill-kumpless tal-ikklonjar African 1, u n-numru żgħir ta' ġenomi minn razez rappreżentattivi ta' Af2 u Eu1, id-dejta tas-sekwenzar oriġinali pprovduta mill-SRA ntużat f'dawn il-każijiet. Ix-xogħol ta' Zimpel u l-kollaboraturi tiegħu (2020) għen biex jiġi identifikat il-ġenoma mill-kumpless tal-ikklonjar imsemmi qabel u għen biex jintgħażel Mycobacterium bovis għall-inklużjoni fis-sett tad-data. Għal Eu3, huwa deskritt tip wieħed biss ta' ġenoma (Branger et al., 2020), għalhekk il-ġenoma li ninkludu huwa rappreżentant separat tal-kumpless Eu3.
Globalment, dan is-sett ta' dejta jinkludi 70 baqar M. bovis iżolati minn 8 speċi ospitanti, imqassma fi 12-il pajjiż mill-1985 sal-2016. 36 speċi huma ddeżinjati bħala Eu2, 7 speċi huma Eu1, speċi waħda hija Eu3, 3 speċi huma Af1, 4 speċi huma Af2 u 19 mhumiex attribwibbli għal xi kumpless klonali (dettalji hawn taħt). L-informazzjoni dettaljata (inkluż in-numru ta' aċċessjoni) ta' Mycobacterium bovis użata f'dan l-istudju hija murija fit-Tabella 1 u t-Tabella Supplimentari 1.
42 ġenoma sħaħ ta' Mycobacterium bovis sekwenzati ġodda minn hotspots tat-tuberkulożi tal-annimali fil-Portugall u mqassma għal aktar minn 12-il sena huma ċ-ċentru ta' dan l-istudju, peress li s-sistemi potenzjali ta' mard bejn il-ħajja selvaġġa u l-bhejjem ġew immonitorjati regolarment 31,36 (Fig. Supplimentari 1). Skont proċeduri sussegwenti, dawn ir-razez ġew iżolati mill-baqar (n = 14), iċ-ċriev aħmar (n = 16) u l-ħanżir selvaġġ (n = 12) mill-2003 sal-2015: iġbor u immaniġġja l-annimali skont il-linji gwida tal-protokoll rakkomandati. Il-kampjuni tat-tessut jinsabu fil-Manwal tal-Annimali Terrestri tal-OIE u huma inokulati fuq mezz solidu u mezz likwidu tal-piruvat Stonebrink u Löwenstein-Jensen. Il-kulturi huma inkubati f'temperatura ta' 37 °C u t-tkabbir jiġi ċċekkjat darba fil-ġimgħa għal mill-inqas 12-il ġimgħa. Il-kolonji huma maħżuna direttament f'soluzzjoni ta' gliċerol f'temperatura ta' -80ºC. Fil-mezz selettiv tal-Mycobacterium (Middlebrook 7H9, BD Diagnostics), il-kampjuni oriġinali arkivjati għaddew minn passaġġ wieħed in vitro in vitro biex jinkiseb id-DNA tal-programm WGS. Għal dan, is-soluzzjoni tal-istokk tal-kultura ffriżata ġiet arrikkita b'5% sodium pyruvate u 10% ADS (50 g albumina, 20 g glukożju, 8.5 g sodium chloride f'1 L ilma) fuq Middlebrook 7H9 f'37°C Retrain. Wara 4 ġimgħat ta' tkabbir, il-mezz ġie mġedded u l-kultura ġiet immonitorjata regolarment sakemm ġie osservat it-tkabbir. Iċ-ċelloli nġabru permezz ta' ċentrifugazzjoni, il-gerbub ġie sospiż mill-ġdid f'500 µL salina bufferizzata bil-fosfat (PBS), imsaħħan f'99 °C għal 30 minuta, ċentrifugat, u s-supernatant inħażen f'-20 °C sakemm isir il-WGS. Il-proċeduri kollha jitwettqu f'faċilitajiet ta' bijosigurtà tal-livell 3.
Il-librerija tal-ġenoma WGS paired-end hija ppreparata bl-użu tal-indiċi uniku ta' kull kampjun tad-DNA, u tuża t-teknoloġija Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 kampjun) u HiSeq (2 × 150 pb) (żewġ iżolati) (Eurofins Genomics, il-Ġermanja) għas-sekwenzar. Skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur, uża l-Illumina Genome Analyzer b'aċċessorju ta' modulu b'żewġ truf biex tissekwenza d-DNA ġenomiku, u uża n-Nextera XT DNA Library Prep Kit minn Illumina biex tibni l-librerija.
Meta wieħed iqis id-dejta rkuprata mill-SRA (n = 12), l-identifikazzjoni tal-kumpless tal-klonu tista' tintuża bħala l-metadata tal-pubblikazzjoni korrispondenti 30, 41, 43. Meta wieħed jikkunsidra l-ġenoma sħiħ, ħlief għal Mycobacterium bovis AF2122/97 u Mycobacterium bovis 3601, li huma membri rikonoxxuti tal-kumpless klonali Eu1 u Eu3 25, 29, rispettivament, huwa l-istess bħall-ġenoma sħiħ ta' Mycobacterium tuberculosis H37Rv (numru ta' aċċessjoni NCBI NC_000962.3). L-allinjament tal-ġenoma jitwettaq bl-użu tal-MAFFT (programm ta' allinjament multiplu ta' sekwenza ta' amino acidi jew nukleotidi, verżjoni 7.458) u l-parametru -addfragments48. Imbagħad, fittex l-assenza ta' kumplessi klonali differenti u/jew il-preżenza ta' karatteristiċi SNP.
Il-Mycobacterium bovis (n = 42) li għadu kif ġie sekwenzat u l-qari oriġinali tal-abbozz tal-ġenoma mmuntat (n = 3) jallinjaw il-kumpless mal-ġenoma ta' referenza Mycobacterium tuberculosis H37Rv permezz tal-pipeline vSNP u l-preżenza tat-tħassir u/jew il-karatteristiċi SNP ta' kloni differenti. Twettqet tfittxija.
Iġbor informazzjoni min-nuqqas ta' karatteristiċi u/jew il-preżenza/assenza ta' SNP u profili ta' spoligotyping biex tassenja dejta ġenomika lill-kumpless klonali korrispondenti. Għall-erba' assemblaġġi abbozzati, il-profil ta' spoligotyping ma jistax jiġi inferit, għalhekk huma inklużi fil-grupp "mingħajr kumplessità".
Il-fluss tax-xogħol tal-bijoinformatika segwit minn dan ix-xogħol jibda mill-assemblaġġ de novo u l-immappjar għal strateġija ta' referenza, bil-għan li jiġu esplorati avvenimenti ta' rikombinazzjoni u polimorfiżmi speċifiċi tal-ġenoma. Il-Figura 1 tipprovdi dijagramma tal-fluss tal-passi segwiti. Għall-analiżi tar-rikombinazzjoni, il-ġenomi kollha jintużaw biex tiżdied ir-robustezza tal-inferenzi u l-indikaturi relatati.
Sabiex innaqsu l-iżbalji fil-ġenerazzjoni ta' sekwenzi ta' kunsens tal-ġenoma, l-ewwel ksibna assemblaġġ de novo, u mbagħad ksibna allinjamenti multipli ewlenin. Il-pipeline Unicycler bħalissa huwa disponibbli fuq https://github.com/rrwick/Unicycler49 u jintuża biex iwettaq assemblaġġ de novo ta' 54 ġenoma sekwenzati (42 sekwenzati ġodda u 12-il fajl fastq irkuprati minn SRA). Fil-qosor, qabel l-assemblaġġ mill-bidu, twettqet analiżi tal-kwalità tal-qari fil-verżjoni FastQC 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC), u l-verżjoni Trimmomatic 0.36 (l-għażla "qtugħ tal-Adapters u sekwenzi oħra speċifiċi għad-dawl mill-qari" u "Aqta' l-bażijiet mit-tmiem tal-qari, jekk tkun inqas mill-kwalità limitu ta' 20" huma applikati) (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50. Imbagħad, SPAdes optimizer49 intuża għall-assemblaġġ tal-ġenoma, u Pilon verżjoni 1.1851 intużat għall-ottimizzazzjoni ta' wara l-assemblaġġ. Intgħażel mod konservattiv ta' bridging biex jiġi evitat assemblaġġ mhux korrett, u d-daqs tal-k-mer ġie mfittex u magħżul bejn 20% u 95% tat-tul tal-qari. Segwi l-linji gwida tal-SPAdes u kkunsidra d-daqs tal-qari, ħassar il-contigs iżgħar minn 300 bp, u stabbilixxi limitu ta' kopertura ta' fond ta' qari ta' 20 ta' 52. Fl-istrateġija ta' assemblaġġ de novo, reġjuni ġenomiċi bħall-paralogi ripetittivi ħafna tal-proline-glutamate (PE) u tal-proline-proline glutamate (PPE) ma tneħħewx.
Il-kwalità tal-assemblaġġ de novo hija vvalutata permezz tal-pipeline QUAST (http://quast.sourceforge.net/quast.html), li jiffaċilita t-tiġdid tal-contig u l-Immappjar tal-ġenoma ta' referenza M. bovis AF2122/97 (numru ta' aċċessjoni NCBI LT708304.1) (ara t-Tabella Supplimentari 1 għall-parametri tal-kwalità).
Bl-għajnuna tal-pipeline vSNP (https://github.com/USDA-VS/vSNP), il-fajl FASTQ tal-M. bovis sekwenzat ġdid mis-sekwenzar tal-Illumina jitqabbel mal-ġenoma ta' referenza tal-M. bovis AF2122/97 (LT708304.1)). Skont ir-rakkomandazzjonijiet tal-aħjar prattika tal-Genome Analysis Toolkit (GATK) 53, 54, 55, applika parametri standard tal-filtru jew punteġġi tal-massa tal-varjant għall-kalibrazzjoni mill-ġdid. Ir-riżultati jiġu ffiltrati bl-użu tal-inqas punteġġ tal-massa SAMtools ta' 150 u AC = 2. Uża wkoll Kraken (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) biex tiċċekkja l-qari biex teskludi l-kontaminazzjoni. Il-pipeline vSNP użat biex jimmappa għal strateġiji ta' sekwenza fix-xogħol tagħna jeżamina serje ta' SNPs u miri definiti, u jeskludi wkoll xenarji ta' infezzjoni mħallta. Il-kopertura tal-ġenoma moqrija hija aħjar minn 99% (Tabella Supplimentari 1).
Biex tevita żbalji fl-immappjar u SNPs żbaljati, iffiltra varjant fil-każijiet li ġejjin: (1) huwa appoġġjat minn inqas minn 20 qari, (2) jinstab bi frekwenza ta' inqas minn 0.9, (3) jinsab f'mill-inqas Razza waħda, iżda mill-inqas hemm lakuni f'razza oħra. Il-viżwal tal-ġenomika integrat (IGV) verżjoni 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 intuża biex jivverifika viżwalment l-SNPs u l-pożizzjonijiet bi problemi ta' mmappjar jew allinjament. Peress li l-ġeni tal-proline-glutamate (PE) u tal-proline-proline glutamate (PPE) huma duplikati ħafna u huma parti minn familja b'ħafna ġeni, huma faċilment mifhuma ħażin mis-sekwenzar u l-immappjar ħażin tal-Illumina, għalhekk huma preferuti. Il-fluss tax-xogħol tal-bijoinformatika mikobatterjali neħħa membri tal-kumpless tat-tuberkulożi meta uża l-istrateġija tal-immappjar għas-sekwenza biex jikkonferma l-SNPs. Għalhekk, iffiltrajna l-ġeni PE/PPE u l-indels mill-analiżi.
Skont Bovilist (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), l-SNPs kollha huma maqsuma f'kategoriji funzjonali. Il-pipeline SnpEff (https://pcingola.github.io/SnpEff/) jintuża biex jiġu inferiti l-konsegwenzi tal-SNP (bidliet sinonimi jew mhux sinonimi). Ħoloq database ġdida tal-ġenoma Mycobacterium bovis AF2122/97 (LT708304.1).
L-allinjament multiplu tal-ġenoma ċentrali twettaq bl-użu ta' Parsnp v1.2, bħalissa disponibbli fuq https://github.com/marbl/parsnp57, bl-użu ta' 69 ġenoma/abbozz ta' assemblaġġi kompluti (bl-għażla -c) u M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) jintuża bħala referenza. Twettqu erba' allinjamenti multipli ċentrali: il-membri biss tal-kumpless tal-ikklonjar Eu2 (n = 37), inklużi l-membri kollha tal-kumpless tal-ikklonjar Ewropew (n = 44), inkluż il-punt ta' junction tal-kumpless tal-ikklonjar Ewropew u Afrikan (n = 51), u jinkludu l-Mycobacterium bovis kollu f'dan l-istudju (n = 70).
L-allinjament ewlieni ġġenerat minn Parsnp jintuża biex tiġi dedotta s-siġra filoġenetika tal-massimu ta' probabbiltà (ML) bl-użu ta' CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 bl-użu ta' RAxML, u biex jitwettqu 1000 replikazzjoni ggwidata.
Tliet algoritmi u għodod bijoinformatiċi differenti jintużaw biex tiġi vverifikata l-preżenza ta' avvenimenti ta' rikombinazzjoni b'mod parallel: is-softwer SplitsTree4, il-pipeline Gubbins (nisel imparzjali permezz ta' rikombinazzjoni f'sekwenzi ta' nukleotidi), u s-softwer RDP4 (programm ta' skoperta ta' rikombinazzjoni, verżjoni beta 4.101).
Il-metodu ta' dekompożizzjoni maqsuma implimentat fi SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 jintuża biex jiġi kkalkulat in-netwerk filoġenetiku mingħajr għeruq, bl-użu tat-test Phi għall-verifika statistika, u l-limitu ta' sinifikat huwa p = 0.05. L-analiżi multi-allinjament ewlieni ta' Parsnp tintuża bħala input, u d-dekompożizzjoni maqsuma bħala standard tan-netwerk hija realizzata.
Il-pipeline ta' Gubbins v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 jaħdem b'parametri awtomatiċi bħala mod ieħor biex jiġi evalwat l-impatt tar-rikombinazzjoni fuq Mycobacterium bovis. L-algoritmu implimentat fil-pipeline jirrikonstrwixxi l-linjaġġ tal-kloni rilevanti. L-assemblaġġ sħiħ tal-ġenoma/abbozz tas-sett tad-dejta tagħna u l-ġenoma ta' referenza (bovid bovin AF2122/97, LT708304.1) huma reċiprokament; u jiskennjaw il-pożizzjoni tal-SNP fuq kull fergħa tas-siġra biex jinstab il-grupp ta' SNP li jirrappreżenta l-avveniment ta' rikombinazzjoni. Iż-żero tal-fergħa. Nassumu li m'hemm l-ebda avveniment ta' rikombinazzjoni, li jfisser li l-SNPs li jseħħu fuq il-fergħa għandhom ikunu mqassma b'mod uniformi. L-allinjament multiplu ewlieni minn Parsnp u l-aħjar siġra ML skorjata minn RAxML jintużaw bħala fajls ta' input.
Fl-aħħar nett, sabiex nikkonfermaw l-avveniment ta' riorganizzazzjoni ssuġġerit mill-pipeline ta' Gubbins, is-sitt algoritmi implimentati f'RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 u SiScan66) huma applikati għall-allinjament multiplu ewlieni ta' Parsnp taħt settings awtomatiċi. Iddeterminajna li mill-inqas tlieta mill-algoritmi implimentati f'RDP4 iridu juru b'mod konsistenti sinjal importanti biex jivverifikaw kull avveniment ta' rikombinazzjoni.
Meta wieħed iqis li kemm is-softwer Gubbins kif ukoll dak RDP ifittxu sinjali ta' rikombinazzjoni billi jiċċekkjaw l-allinjamenti multipli ewlenin f'tieqa sa 500 bp, u jikkonfermaw li l-inklużjoni tal-ġeni PE/PPE waqt l-assemblaġġ de novo mhux se tinterferixxi mas-sinjali ta' rikombinazzjoni misjuba, issir analiżi ulterjuri permezz ta' omolinearità. Iċċekkja l-viċinanza tal-ġene li jidentifika l-avveniment ta' rikombinazzjoni. Il-mappa sinlineari bl-użu tal-ġenoma komplut inbniet bl-użu tal-allinjament MAUVE-multi-genome (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) biex teskludi traslokazzjonijiet jew inverżjonijiet lokali tal-ġenoma. Barra minn hekk, il-ġenoma kollu ntuża biex titwettaq analiżi tal-omolinearità fuq is-sekwenza tal-aċidi amminiċi permezz tas-server tal-web SyntTax (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/).
Analiżi aktar fil-fond tas-sett tad-dejta tal-ġenoma miksuba mis-sistema Portugiża tat-tuberkulożi b'ħafna ospiti hija biex tiċċekkja l-polimorfiżmu tal-ġeni msemmija fil-letteratura. Dawn il-ġeni huma 37,38 u l-ġene li jikkodifika 3R miksub mill-antenati MTBC permezz tal-komponenti tas-sistema HGT (tiswija, replikazzjoni u rikombinazzjoni tad-DNA) 39. Uża ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) u uża DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) biex tikkalkula d-diversità tal-ġeni u d-diversità tan-nukleotidi (π) u l-input tal-parametru tat-test newtrali D ta' Tajima.
Inkisbet siġra filoġenetika ta' probabbiltà massima (ML) ibbażata fuq 69 iżolat ta' Mycoplasma bovis u ġenomi ta' referenza (Figura 2A). Meta mqabbla ma' siġar ibbażati fuq ġene wieħed jew siġar ibbażati fuq diversi locus, din l-istrateġija tippermetti l-ġenerazzjoni ta' siġar aktar b'saħħithom li ma jaqbdux il-varjabbiltà tal-ġenoma kollu u għalhekk juru kapaċità aktar baxxa li jiddiskriminaw bejn l-ispeċi 68,69. L-istruttura topoloġika tas-siġra ML ġeneralment hija konsistenti mal-klassifikazzjoni kumplessa tal-kloni. Il-ġenoma ta' Eu2 huwa miġbur f'fergħa, u l-ġenoma ta' Af1 huwa wkoll miġbur flimkien (Figura 2A). Ir-riżultat huwa wkoll konsistenti mar-relazzjoni evoluzzjonarja magħrufa ta' Mycobacterium bovis, jiġifieri, hemm differenza kbira bejn il-membru Eu1 u l-grupp li jikkonsisti mill-kumplessi u l-ġenomi klonali l-oħra kollha, iżda l-kumpless klonali 30 mhux speċifikat. L-inkonsistenza żgħira bejn il-kumpless klonali u r-relazzjoni osservata fuq is-siġra filogenetika tista' tiġi spjegata mill-fatt li l-kumpless klonali huwa deskritt abbażi ta' reġjuni ġenomiċi speċifiċi, filwaqt li s-siġra filogenetika hija bbażata fuq allinjamenti multipli ta' ġenomi ewlenin li jirrappreżentaw il-ġenoma kollu.
Is-siġra filoġenetika tal-massimu probabbiltà (GTR) hija mibnija abbażi tal-allinjament tal-ġenoma ewlieni tal-ġenoma Mycobacterium bovis qabel (A) u wara (B) it-tneħħija tas-sit ta' rikombinazzjoni. Il-kuluri tal-fergħat jirrappreżentaw il-kumpless tal-klonu Mycobacterium bovis: Ewropa 1 hija vjola, Ewropa 2 hija ħamra, Ewropa 3 hija blu, Afrika 1 hija oranġjo, u Afrika 2 hija ħadra. Is-siġra għandha l-għeruq u hija mpinġija fuq skala, u t-tul tal-fergħa jitkejjel bħala sostitut għal kull sit.
Il-kumpless Mycobacterium tuberculosis huwa deskritt bħala li evolva b'mod klonali, u l-biċċa l-kbira tal-evidenza akkumulata matul is-snin tappoġġja l-idea li l-avvenimenti kontinwi ta' HGT u rikombinazzjoni mhux se jseħħu fil-livell li jista' jiġi skopert ta' MTBC15,17,18.
Xogħol preċedenti wera li jista' jkun hemm rikombinazzjoni limitata bejn ir-razez tal-MTBC20,21, filwaqt li oħrajn ma rnexxilhomx jidentifikaw avvenimenti ta' rikombinazzjoni li jistgħu jitkejlu70,71. Erġa' iddiskuti din il-kwistjoni b'fokus fuq Mycobacterium bovis, li huwa differenti mix-xogħol preċedenti li kkunsidra biss Mycobacterium tuberculosis 70,71; jew ikkunsidra l-MTBC kollu kemm hu, bi kważi l-ebda M. bovis li jirrappreżenta 20; jew ikkunsidra biss frazzjonijiet restrittivi tal-baqar. Fis-sett tad-dejta tal-mikobatterji, f'dan ix-xogħol, hemm total ta' 70 razza, li jirrappreżentaw il-kumplessjonijiet klonali kollha, użati għall-iskrinjar għar-rikombinazzjoni. Is-sett tad-dejta huwa skalat skont erba' livelli kumulattivi: (1) membri tal-Eu2, (2) il-membri kollha tal-kumpless tal-kloni Ewropej (jiġifieri l-Ewropa), (3) kumpless tal-kloni Ewropej u Afrikani (Eu + Af) u (4) il-Kollezzjonijiet tad-dejta kollha (inklużi ġenomi li mhumiex inklużi fi kwalunkwe kumpless ta' klonazzjoni diġà deskritt).
Biex tiġi studjata aktar din l-ipoteżi, twettaq netwerk ta' dekompożizzjoni maqsuma biex jiġi vvalutat in-nuqqas ta' avvenimenti ta' rikombinazzjoni bejn il-ġenomi, għaliex dan il-metodu jista' jivviżwalizza r-relazzjoni antenata bejn l-individwi u juri sinjali filogenetiċi konfliġġenti. L-erba' settijiet ta' dejta kollha fl-analiżi kkonfermaw l-eżistenza ta' loops fin-netwerk (jiġifieri, żoni li ma jikkonverġux f'siġra waħda), iżda t-test Phi m'għandu l-ebda appoġġ statistiku (Eu2, p = 0.0956; Ewropa, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; is-sett ta' dejta kollu p = 0.2451), li jipprovdi evidenza fqira għall-eżistenza ta' avvenimenti ta' riorganizzazzjoni (Figura 3A-D).
Fl-Ewropa 2 ġenomi (n = 37) (A), ġenomi Ewropej (n = 44) (B), ġenomi Ewropej u Afrikani (n = 51) (C) u s-sett tad-dejta kollu (n = 70) (D).
Wara din l-analiżi, u b'kont meħud tal-osservazzjonijiet ċikliċi fin-netwerks kollha, l-algoritmu ta' rikostruzzjoni implimentat fil-pipeline ta' Gubbins ġie applikat biex jirrikonstrwixxi l-linja klonali u biex jissupplimenta l-istima tal-effett tar-rikombinazzjoni fuq il-ġenoma ta' M. bovis. Iddeduċi n-numru kumulattiv ta' avvenimenti ta' rikombinazzjoni, li ħafna minnhom seħħew fi friegħi terminali (jiġifieri, f'ġenoma wieħed) (Tabella 2). Dawn l-indikaturi juru l-konsistenza tas-sett tad-dejta kollu u jindikaw li l-frekwenza tal-avvenimenti ta' rikombinazzjoni hija 200 sa 300 darba dik tal-mutazzjonijiet. Ladarba l-parametru rho/theta li jirrappreżenta r-rati relattivi ta' rikombinazzjoni u mutazzjonijiet puntwali fuq il-fergħa jidher li huwa bejn 0.0037 u 0.0056 (Tabella 3). Riċentement, ix-xogħol ippubblikat tat-38 razza M. bovis wera valur rho/theta ogħla (rho/theta = 0.1) minn dak miksub f'dan is-sett ta' dejta, iżda x-xogħol ta' Patané u l-kollegi tiegħu uża assemblaġġ ibbażat fuq referenza biex jiddeduċi l-parametri ta' rikombinazzjoni. Dettall proċedurali, minħabba l-proċedura ta' assemblaġġ, ġie assoċjat mal-abbundanza ta' avvenimenti putattivi ta' rikombinazzjoni fil-fergħa terminali.
Imbagħad, il-parametru r/m jirrappreżenta l-proporzjon tad-diversità tar-rikombinazzjoni u l-introduzzjoni tal-mutazzjoni, u l-valur medju tiegħu huwa bejn 0.025 u 0.037, li jindika li meta mqabbla mal-mutazzjonijiet, ir-rikombinazzjoni għandha impatt ġenerali aktar baxx fuq id-diversità ġenetika ta' M. bovis (Tabella 3). Għal tqabbil estensiv, intuża metodu simili biex jiġi stmat il-parametru r/m għad-dataset tal-MTBC magħmul minn 23 ġenoma, li juri valur medju ta' 0.48620, filwaqt li għad-dataset ta' 38 M. bovis ta' Patané u l-kollegi tiegħu, dan wera li l-valur medju huwa 0.98. Fl-ewwel studju, tnejn biss mit-23 ġenoma ġew inklużi fix-xogħol ta' M. bovis (M. bovis BCG u r-razza ta' referenza), għalhekk il-valur miksub jista' jkun preġudikat minħabba l-espressjoni żejda tal-ġenoma ta' M. tuberculosis. Fit-tieni rapport, il-popolazzjonijiet ta' Mycobacterium bovis analizzati ġew irkuprati prinċipalment mill-Istati Uniti u minn ospiti tal-bhejjem. B'kuntrast, fis-sett tad-dejta tagħna, huma rappreżentati aktar postijiet ġeografiċi u speċi ospitanti, u jintużaw ukoll ġenomi miġbura f'kumplessjonijiet klonali differenti b'karatteristiċi ġenetiċi tal-popolazzjoni differenti, u b'hekk jinkiseb għarfien aktar profond u usa' tal-Popolazzjoni. Id-differenza fil-valur medju r/m miksuba bis-sett tad-dejta tagħna hija konsistenti mal-kunċett li l-grad ta' rikombinazzjoni jvarja ħafna bejn il-linji assenjati lill-istess speċi tassonomiċi, għalhekk dawn ir-riżultati jindikaw li l-kumpless tal-kloni M. bovis jista' juri differenzi fir-rikombinazzjoni. L-impatt huwa wkoll kif issuġġerit minn Didelot & Maiden72. Madankollu, l-espansjoni sinifikanti ta' dan is-sett tad-dejta billi jiġi inkluż numru akbar ta' ġenomi M. bovis se tippermetti aktar kjarifika ta' dan il-punt. Kemm il-parametri r/m kif ukoll rho/theta juru varjabbiltà bejn il-fergħat, u dan ir-riżultat huwa konsistenti mar-rapporti dwar speċi batteriċi oħra72,73.
Fl-aħħar nett, sabiex jiġu kkonfermati l-avvenimenti ta' riorganizzazzjoni identifikati mill-pipeline ta' Gubbins, intużaw sitt algoritmi differenti fis-softwer RDP4 biex jiġu ttestjati b'mod indipendenti multi-paraguni ewlenin differenti. Globalment, inqas minn nofs l-avvenimenti identifikati minn Gubbins ġew ikkonfermati minn RDP4 (Tabelli 4 u 5). Meta wieħed iqis is-sett tad-dejta kollu, ġew ikkonfermati tliet avvenimenti ta' rikombinazzjoni, tnejn li jinvolvu nodi interni u l-ieħor li jinvolvi ġenoma waħda f'fergħa terminali, li għalihom ma setgħux jiġu assenjati kumplessi klonali (Tabelli 4 u 5). L-identifikazzjoni ta' avvenimenti fil-fergħat terminali tista' tindika li r-rikombinazzjoni għadha għaddejja f'razez kontemporanji ta' M. bovis jew ir-riżultat mhux f'post xieraq70. F'dan ir-reġjun ipotetiku ta' rikombinazzjoni, madwar 20% tal-pożizzjonijiet għandhom nukleotidi (N) mhux definiti, u b'hekk jaffettwaw is-sinjal ta' rikombinazzjoni (Figura Supplimentari 2). Barra minn hekk, dan ir-reġjun jaffettwa l-ġene rrs, li jikkodifika l-RNA ribosomali 16S li huwa mistenni li jkun ikkonservat ħafna, għalhekk dan is-sinjal ta' rikombinazzjoni putattiv jista' jkun ir-riżultat ta' żbalji fis-sekwenzar jew allinjament ħażin. Imbagħad sar l-allinjament tal-ġenoma kollu bejn Mb0003 u Mycobacterium bovis AF2122/97, u ġiet ikkonfermata l-eżistenza ta' nukleotidi u SNPs mhux definiti, għalhekk il-problemi possibbli relatati mal-allinjament żbaljat ma kinux dovuti għall-informazzjoni bijoloġika implimentata f'dan ix-xogħol li dehret wara li tgħallmet il-programm.
Ma nstabu l-ebda lakuni jew nukleotidi mhux definiti fir-reġjuni ta' rikombinazzjoni tan-nodi interni (Figuri 4 u 5). Rigward dawn l-avvenimenti, wieħed fih biss il-ġenoma Eu2 u jaffettwa l-ġene pks12, li jikkodifika polyketide synthase possibbli; filwaqt li l-ieħor huwa rreġistrat fil-ġenoma Eu1 u jaffettwa l-ġene narX li jikkodifika nitrate reductase possibbli (Tabella 4). B'mod ġenerali, l-analiżi tar-rikombinazzjoni turi li hemm numru limitat ta' frammenti ta' rikombinazzjoni b'appoġġ statistiku, u l-indikaturi inferiti jindikaw li r-rikombinazzjoni għandha impatt baxx fuq il-linjaġġ ta' M. bovis. Is-sinjal tar-rikombinazzjoni huwa mistenni li jkun baxx, iżda huwa importanti li wieħed jiddistingwi s-sinjal tal-evoluzzjoni veru mill-istorbju fl-isfond, li huwa kompitu diffiċli. Sabiex jitnaqqas is-sinjal tal-istorbju introdott minn problemi ta' assemblaġġ ibbażat fuq referenza u problemi ta' nuqqas ta' qbil 70, 71, il-bqija kollha ħlief il-ġenoma komplut ġew immuntati mill-bidu, u l-kwalità tal-assemblaġġ ġiet iċċekkjata u żgurata permezz tal-analiżi tal-pipeline QUAST (Tabella Supplimentari 1). Barra minn hekk, twettqet serje ta' analiżijiet supplimentari biex tiġi pprovduta r-robustezza u l-eżattezza tal-istħarriġ ġenerali. Għalhekk, il-kwalità tas-sekwenzar tal-ġeni narX u pks12 ġiet evalwata permezz ta' mmappjar tal-qari kontra Mycobacterium bovis AF2122/97. Il-pożizzjoni rakkomandata tal-SNP fir-reġjun tar-rikombinazzjoni ġiet ikkonfermata bl-applikazzjoni tal-kriterji msemmija fit-taqsima tal-metodu (mill-inqas 20 qari u frekwenza ta' bidla ta' 0.9). Il-polimorfiżmu tal-ġene narX ġie kkonfermat bis-sħiħ fiż-żewġ ġenomi (Mb1792361 u Mb7240415; 2.3%) u l-ġenomi tal-ġenoma pks12: ġeni Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756, u Mb12. Madankollu, għall-ġenoma Mb2043, sitta mit-tmien pożizzjonijiet ma jissodisfawx il-kriterju tal-fond tal-qari għaliex l-SNP huwa appoġġjat minn massimu ta' 17-il qari, li huwa taħt il-valur limitu stabbilit ta' 20. Għalhekk, ir-rikombinazzjoni ta' sitt ġenomi (8.6%) f'dan is-sit tal-ġenoma tista' tiġi kkonfermata (Figuri 4 u 5).
Il-viżwalizzazzjoni dettaljata tal-allinjament tar-reġjun ta' rikombinazzjoni tad-dataset Mycobacterium bovis taffettwa l-ġene narX li jikkodifika nitrate reductase possibbli. Ma nstabu l-ebda lakuni jew nukleotidi mhux definiti fir-reġjun ta' rikombinazzjoni tan-nodi interni. Dan l-avveniment partikolari huwa rreġistrat fil-ġenoma Eu1. Il-kwalità tas-sekwenzar tal-ġene narX ġiet evalwata billi ġew ipplottjati l-qari ta' Mycobacterium bovis AF2122/97. Ikkonferma l-post rakkomandat tal-SNP fiż-żona ta' rikombinazzjoni billi tapplika l-kriterji msemmija fit-taqsima tal-metodu (mill-inqas 20 qari u frekwenza ta' bidla ta' 0.9). Il-polimorfiżmu tal-ġene narX ġie kkonfermat bis-sħiħ fil-ġenomi ta' Mb1792361 u Mb7240415 (2.3%).
Viżwalizzazzjoni dettaljata tal-allinjament tar-reġjun ta' rikombinazzjoni tad-dataset ta' Mycoplasma bovis li jaffettwa l-ġene pks12. Ma nstabu l-ebda lakuni jew nukleotidi mhux definiti fir-reġjun ta' rikombinazzjoni tan-nodi interni. Rigward l-avveniment li jaffettwa l-ġene pks12 li jikkodifika s-sintasi possibbli tal-poliketide, dan fih biss il-ġenoma Eu2. Il-kwalità tas-sekwenzar ta' pks12 ġiet evalwata permezz tal-immappjar tal-qari ta' Mycobacterium bovis AF2122/97. Ikkonferma l-post rakkomandat tal-SNP fiż-żona ta' rikombinazzjoni billi tapplika l-kriterji msemmija fit-taqsima tal-metodu (mill-inqas 20 qari u frekwenza ta' bidla ta' 0.9). Il-polimorfiżmi tal-ġenomi Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043, u Mb1960 ġew ikkonfermati bis-sħiħ.
Il-ġeni PE u PPE għandhom reġjuni ripetittivi li faċilment jinqraw ħażin mis-sekwenzar u l-immappjar ħażin tal-Illumina, għalhekk ġeneralment jitħassru mill-fluss tax-xogħol bijoinformatiku tal-membri tal-M. tuberculosis biss meta tintuża l-istrateġija tal-immappjar għal sekwenza. L-inferenza tal-avvenimenti ta' rikombinazzjoni applikata f'dan ix-xogħol hija bbażata fuq assemblaġġ de novo mingħajr ma jiġu ffiltrati l-PE/PPE. Aħna nemmnu li bl-implimentazzjoni ta' tliet metodi u algoritmi komplementari differenti permezz ta' SplitsTree, il-pipeline Gubbins u s-softwer RDP4, l-istrateġiji applikati huma robusti għall-ipproċessar u l-iffiltrar tar-reġjuni riorganizzati kkawżati minn sinjali ta' żball. Madankollu, sabiex tiġi eskluża l-interferenza tal-ġene PE/PPE fuq is-softwer Gubbins u RDP4 biex jiġu identifikati gruppi ta' SNP, u għalhekk l-identifikazzjoni tar-reġjuni ta' rikombinazzjoni proposti li jaffettwaw il-ġeni narX u pks12, ġie eżaminat il-viċinat ta' dawn il-ġeni (Fig. Supplimentari 3–5). F'M. bovis AF2122/97, il-ġene narX huwa separat minn narK2 u Mb1764c, filwaqt li pks12 huwa mdawwar minn Mb2075c u Mb2073c (Figura Supplimentari 3-5). Il-mappa ġġenerata bl-użu tal-mappa tas-sinlinja MAUVE tal-ġenoma komplut tipprovdi informazzjoni dwar il-konservazzjoni u r-riarranġament tas-sekwenza tal-ġene, li turi erba' blokki kolineari, u l-ebda sinjal ta' traslokazzjoni jew inverżjoni tal-ġenoma. Barra minn hekk, l-analiżi tal-komplementazzjoni bis-sekwenza tal-aċidi amminiċi wriet l-omoloġija fil-ġenomi kompluti kollha, u ma nstab l-ebda PE/PPE fir-reġjuni biswit narX jew pks12. Għal narX, ġenoma wieħed (Mb0030) għandu punteġġ ta' sinonimija aktar baxx għaliex il-ġene narX ġie identifikat bħala żewġ frammenti (frammenti 1891 u 1890). Għal pks12, minħabba x-xebh, Mb0030 u Mb003 urew punteġġi ta' sinlinearità aktar baxxi, filwaqt li pks12 ġie identifikat f'żewġ u tliet frammenti, rispettivament, li jirrappreżentaw dominji differenti tal-proteina (Figura Supplimentari 3-5). Meta nqisu din l-informazzjoni, u kemm is-softwer Gubbins kif ukoll dak RDP4 iwettqu analiżi, jivverifikaw l-allinjament multiplu ewlieni tal-massimu ta' 500 bp fit-tieqa, u kkonfermajna li l-ġene PE/PPE mhux se jinterferixxi mas-sinjal ta' rikombinazzjoni li jaffettwa narX u pks12.
Għalkemm is-sinjali ta' rikombinazzjoni skoperti f'dan is-sett ta' dejta jistgħu jitqiesu bħala residwi, huwa minnu li r-rikombinazzjoni f'M. bovis ma tistax tiġi eskluża, għalhekk għandha tkompli tkun is-suġġett ta' aktar analiżi, fejn ġenomi sħaħ minn xenarji epidemjoloġiċi differenti jiġu sekwenzati għal Importanti.
It-tqabbil tas-siġar filogenetiċi ML miksuba qabel u wara l-korrezzjoni tar-rikombinazzjoni (Figura 2A, B) ma wassalx għal bidliet sinifikanti fir-relazzjoni filogenetika inferita, u r-razez ta' M. bovis ġew miġbura fl-istess grupp.
Wara li ġew immappjati 42 qari ġdid ta' M. bovis sekwenzat mal-ġenoma ta' referenza ta' M. bovis AF2122/97, inkiseb allinjament ta' SNPs li fih 1816-il pożizzjoni polimorfika. Il-biċċa l-kbira tal-SNPs (87.1%) jinsabu fir-reġjun tal-kodifikazzjoni, u l-ġeni affettwati huma kkaratterizzati skont il-kategoriji funzjonali murija f'Bovilist (Figura 6A, B). Meta wieħed iqis in-numru totali ta' ġeni f'kull kategorija funzjonali, il-ġeni fil-kategorija "metaboliżmu tal-lipidi" wrew aktar SNPs, segwiti minn "proċessi tal-ħajt taċ-ċelluli u taċ-ċelluli" u "metaboliżmu u respirazzjoni intermedji", li juru li jinsabu fl-evoluzzjoni ta' M. bovis.
Analiżi ġerarkika tad-dataset ta' M. bovis mill-Portugall (n = 42). In-numru totali ta' SNPs irreġistrati u ġeni affettwati għal kull kategorija funzjonali (A). In-numru totali ta' bidliet sinonimi u mhux sinonimi rreġistrati skont il-kategorija tal-funzjoni (B).
Fuq skala globali, il-proporzjon medju ta' dN/dS huwa aħjar minn 1.5, li jindika li l-pressjoni evoluzzjonarja globali hija li teħles mill-istat antenat u tirrappreżenta xenarju ta' għażla ta' purifikazzjoni pożittiva (diversifikata jew diretta) u/jew rilassata. Fil-kategoriji ta' "virulenza, ditossifikazzjoni, adattament", "sekwenzi ta' inserzjoni u faġi", u "proteini regolatorji", aktar minn żewġ terzi tal-SNPs mhumiex sinonimi (Figura 6B).
Fil-kategoriji kollha, hemm ġeni b'SNPs multipli, li jirriżultaw f'rata medja ta' mutazzjoni (jiġifieri, l-SNP medju għal kull ġene) akbar minn 1 (Figura 6A). Pks12 (Mb2074c) bi 15-il SNP u fas (Mb2553c) bi 8 SNPs għandhom valuri ta' mutazzjoni ogħla. Dawn iż-żewġ ġeni huma involuti fil-metaboliżmu tal-aċidi grassi. Il-ġene pks jikkodifika l-polyketide synthase (PKS), li huwa enzima multifunzjonali involuta fil-bijosintesi tal-lipidi tal-ħajt taċ-ċellula mikobatterjali74,75. Dan il-ġene jikkodifika polipeptid multifunzjonali li huwa involut fis-sintesi tal-mikoketidi74,76. Il-ġene fas huwa involut fis-sintesi tal-aċidu mikoliku. Dawn iż-żewġ ġeni għandhom rwol importanti fil-bijosintesi tal-ħajt taċ-ċellula f'kuntatt mal-ospitanti.
Sabiex tiġi studjata aktar l-evoluzzjoni ta' Mycobacterium bovis, ġew analizzati żewġ settijiet ta' ġeni speċifiċi. Xogħlijiet ippubblikati qabel bl-użu ta' metodi ta' kompożizzjoni tas-sekwenza u filogenetiċi identifikaw ġeni li ġew akkwistati minn antenati MTBC permezz tal-HGT qabel id-diversifikazzjoni37,38. Dawn il-ġeni huma elenkati fit-Tabella Supplimentari 2. Id-distribuzzjoni tal-SNP ta' total ta' 77 ġene li jistgħu jkunu relatati mal-HGT ġiet analizzata, u ġew identifikati 26 sit polimorfiku, li fil-biċċa l-kbira tal-każijiet (78%) irriżultaw fi bidliet mhux sinonimi (NS) (Tabella Supplimentari 2). Xogħol preċedenti fuq il-ġenoma MTBC wera li r-reġjun putattiv tal-HGT juri proporzjon ogħla ta' SNP NS meta mqabbel mal-bqija tal-ġenoma. Jekk wieħed jaħseb li dawn ir-reġjuni ta' rikombinazzjoni ġew akkwistati minn antenati MTBC, u għalhekk, jirrappreżentaw żżejjed polimorfiżmi antiki, allura l-proporzjon ta' bidliet sinonimi huwa mistenni li jkun ogħla, għaliex is-sostituzzjonijiet NS huma mistennija li jiġu eliminati permezz ta' selezzjoni negattiva minħabba li l-bidliet fl-aċidi amminiċi jistgħu jibdlu l-funzjoni tal-proteina. Għalhekk, ir-riżultati tagħna jindikaw li l-konsegwenzi funzjonali jistgħu jirriżultaw mis-sostituzzjoni ta' ġeni simili għall-HGT, li jirrifletti l-importanza tagħhom għal diversità ġenetika adattiva siewja.
B'mod parallel ma' din l-analiżi, il-ġeni li jikkodifikaw il-komponenti tas-sistema 3R (tiswija tad-DNA, replikazzjoni, u rikombinazzjoni) ġew eżaminati bir-reqqa skont il-lista ppubblikata qabel minn dos Vultos u l-kollaboraturi (2008)39. L-iskambju ta' frammenti ta' DNA identiċi ma jistax jiġi osservat direttament, għalkemm jista' jkun proċess frekwenti meta jkunu involuti batterji relatati mill-qrib, bħal fil-każ ta' dan is-sett ta' dejta; barra minn hekk, dan il-proċess jista' jkun iċ-ċavetta għall-metodi ta' tiswija tad-DNA72, u għalhekk għandu rwol fir-rikombinazzjoni omologa. Ġew identifikati total ta' 26 pożizzjoni polimorfika mqassma minn 54 ġene (Tabella Supplimentari 3). F'dan is-sett ta' ġeni, il-bidliet fl-NS kienu responsabbli għal madwar 65% tal-konsegwenzi, li huwa konsistenti ma' rapporti preċedenti dwar razez ta' Mycobacterium tuberculosis.
Ħin tal-posta: 21 ta' Ottubru 2021