د بیا ترکیب، بدلون، او مثبت انتخاب د جینوم پراخه اټکلونه د مایکوباکټیریم بوویس متنوع چلوونکي هڅوي

د نیچر لیدلو لپاره مننه. هغه براوزر نسخه چې تاسو یې کاروئ د CSS لپاره محدود ملاتړ لري. د غوره تجربې لپاره، موږ سپارښتنه کوو چې تاسو د براوزر نوې نسخه وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت بند کړئ). په ورته وخت کې، د دوامداره ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ به پرته له سټایلونو او جاواسکریپټ سایټونه وښیو.
د جینوم ترتیب د ساري ناروغیو د څیړنې ساحه بیا را ژوندۍ کړې، د ناروغیو ایپیډیمولوژي، رنځپوهنه، کوربه- رنځپوهنه تعاملات، او د رنځپوهنې باندې تحمیل شوي ارتقايي پروسې څرګندوي. د مایکوباکټیریم توبرکلوز کمپلیکس (MTBC) مایکوباکټیریم بوویس د خپلو څارویو د تطبیق وړ غړو څخه یو ګڼي چې په ځمکنیو تی لرونکو حیواناتو کې د نري رنځ (TB) لامل کیږي، او د باکتریا د ارتقا یو ځانګړی ماډل دی. د MTBC د نورو غړو په څیر، مایکوباکټیریم بوویس په کلکه کلون شوی، ورو ورو وده کونکی رنځجن ګڼل کیږي، او په څرګنده توګه د بیا یوځای کیدو یا افقي جین لیږد هیڅ نښه شتون نلري. پدې کار کې، موږ د 70 غواګانو M څخه جوړ شوي بشپړ جینوم ترتیب (WGS) ډیټاسیټ ته پرتله کونکي جینومیکونه پلي کوو. د مختلفو نسلونو (اروپا او افریقا) څخه د غواګانو M. د جینیاتي تنوع په اړه بصیرت ترلاسه کولو لپاره. ارتقايي ځواک. د بیا تنظیم کولو نښو اټکل کولو لپاره درې مختلف میتودونه کارول کیږي. په نړیواله کچه، د بیا یوځای کیدو لږ شمیر پیښې د دوه خپلواکو میتودونو لخوا پیژندل شوي او تایید شوي چې قوي ملاتړ لري. سره له دې، د بدلونونو په پرتله، بیا یوځای کیدل د M. bovis په تنوع باندې کمزوری اغیزه لري (په ټولیز ډول r/m = 0.037). زموږ د معلوماتو سیټ کې د مایکوباکټیریم بوویس په کلونل کمپلیکس کې ترلاسه شوي r/m اوسط توپیر د عمومي مفهوم سره مطابقت لري چې د بیا یوځای کیدو کچه ممکن د ورته ټیکسونومیک ډولونو ته ټاکل شوي نسبونو ترمنځ خورا توپیر ولري. د دې کار پراساس، په مایکوباکټیریم بوویس کې بیا یوځای کیدل رد نشي کیدی، نو دا باید د راتلونکي پرتله کونکي جینومیک څیړنې کې د نورو هڅو موضوع وي، په کوم کې چې د نړۍ په کچه د مختلفو ایپیډیمولوژیکي سناریوګانو څخه د لویو معلوماتو سیټونو WGS خورا مهم دی. بیا د څو کوربه TB خپریدو څخه د کوچني مایکوباکټیریم بوویس معلوماتو سیټ (n = 42) باندې اضافي تحلیل ترسره شو، او له 1,800 څخه ډیر ځایونه پیژندل شوي، چې لږترلږه یو فشار یو واحد نیوکلیوټایډ پولیمورفیزم (SNP) ښودلی. ډیری (87.1٪) د کوډ کولو په سیمه کې موقعیت لري، او د غیر مترادف بدلونونو (dN/dS) نړیوال تناسب د 1.5 څخه ډیر دی، دا په ګوته کوي چې مثبت انتخاب د M. bovis په اړه کارول شوی یو مهم ارتقايي ځواک دی. د SNPs لوړه برخه په جینونو کې کشف شوه چې د "لیپید میټابولیزم"، "حجروي دیوال او حجروي پروسې"، او "منځني میټابولیزم او تنفس" په فعال کټګوریو کې بډایه دي، چې د مایکوباکټیریم بوویس اهمیت په بیولوژي او ارتقا کې د دوی ظرفیت څرګندوي. د MTBC پلرونو کې جینونو ته نږدې کتنه چې د افقي جین لیږد ته لیواله دي او په 3R (DNA ترمیم، نقل، او بیا ترکیب) سیسټم کې شامل دي د تایجیما د D غیر جانبدار ازموینې نړیوال اوسط منفي ارزښت څرګندوي، کوم چې د تیرو انتخابي سکین کولو ته اشاره کوي. د نفوس پراخیدو وروسته وروستی خنډ لاهم د کوربه سره د مبارزې لپاره د لازمي رنځجن مایکوباکټیریم بوویس لپاره اصلي ارتقايي چلونکی فاکتور دی.
د مایکوباکټیریم توبرکلوز کمپلیکس (MTBC) د باکتریایي ناروغیو یو له خورا بریالي ټیکسا څخه دی او د باکتریا د تکامل یوه عادي قضیه ده. د دې غړي په جینومیک کچه (> 99٪) کې د حیرانتیا وړ لوړ نیوکلیوټایډ پیژندنه ښیې 1,2. د MTBC مختلف ایکوټایپونه کولی شي د نري رنځ (TB) لامل شي، کوم چې یو ساري ګرانولوماتوس ناروغي ده، د کوربه ډولونو په پراخه لړۍ کې د مایکرو تی لرونکو څخه تر انسانانو پورې 3,4,5. اوس مهال، په دې کمپلیکس کې انسانان شامل دي [M. Tuberculosis (Mtb)، Mycobacterium africanum] او د څارویو سره تطابق شوي رنځجنونه (Mycobacterium bovis، Mycobacterium capitum، Mycobacterium pinnipedum، Mycobacterium microtobacter، Mycobacterium mongee، Mycobacterium miysani، Mycobacterium surika، "Bacillus chimpanze" او "dassie") 5,6. ایم کینیټي (چې د "نوډوباکټیر ګلابراټا" په نوم هم پیژندل کیږي) د پورته ذکر شوي مایکوباکټریا سره د نیوکلیوټایډ اوسط پیژندنه 98٪ ده، او د پرتلیزې جینومیک کار ښودلې چې ایم کینیټي او د MTBC پاتې برخه پدې وروستیو کې د عام اناث څخه جلا شوي دي.7 د دې مفهوم په پام کې نیولو سره، ځینې لیکوالان ایم کینیټي د MTBC 8 غړی بولي.
MTBC په سیستماتیک ډول د یو سخت کلونل کمپلیکس په توګه تشریح شوی، او د هغې د نفوس جوړښت په څرګنده توګه د کم شوي تنوع، خنډونو، انتخابي سکین کولو، او جینیاتي ډرافټ لخوا اداره کیږي9,10. فرض کړئ چې پیچلي سخت کلونل ارتقا، لکه ورک شوي پولیمورفیزمونه د بیا ترکیب له لارې نشي بیرته راګرځیدلی. د دې اساس پر بنسټ، د توپیر سیمې (RD) او TbD1 (Mtb ځانګړي حذف 1 سیمه) د جینومیک حذف کولو پرله پسې پیښې د MTBC ارتقا 2,5,11 د مالیکولي نښه کونکو په توګه وړاندیز شوي. د پرتلیزې جینومیک او بشپړ جینوم ترتیب (WGS) کار د انسان سره تطابق شوي غړو په نهو نسبونو ویشلو ملاتړ کوي (مایکوباکټیریم ټوبرکلوسس L1 څخه L4، L7، او L8؛ او مایکوباکټیریم افریکنم L5، L6، او L9)، نسبونه L2 څخه L4 شریک شوي حذف TbD1 سیمه 2,11,12,13. برسېره پردې، د څارویو سره تطابق شوي غړي وړاندیز کیږي چې یو ګډ اناث شریک کړي، کوم چې په RD7، RD8، RD9 او RD102، 5، او 14 کې د کلیډ ځانګړي حذف کولو لخوا تعریف شوی.
د افقي جین لیږد (HGT) او بیا یوځای کیدو پیښې نادره ګڼل کیږي او د MTBC په پلرونو کې پیښیږي، د MTBC ټول غړي د مختلف تاریخ پرځای 15,16,17. د هیوز او همکارانو (2002) او ګوټیکر او همکارانو (2006) لخوا دوه لومړني راپورونه وړاندیز کوي چې د بیا یوځای کیدو پیښې ممکن د پولیمورفیزمونو په شکل کې مرسته وکړي چې د M. tuberculosis strains18,19 کې ځانګړي ځای په نښه کوي. په MTBC کې د بیا یوځای کیدو د څرګند نشتوالي دلیلونه دا دي: (1) میخانیکي پروسه او د HGT وړتیا له لاسه ورکول؛ (2) د HGT پیښو نادریت؛ (3) د MTBC طاق کې د بیا یوځای کیدو پیښو هیڅ چانس شتون نلري 14,17. پدې وروستیو کې، د MTBC strain 20 او Mycobacterium bovis 21 باندې پلي شوي ځینې بشپړ جینوم ترتیب (WGS) مطالعاتو د بیا یوځای کیدو شواهد چمتو کړي، لومړی یې وښودله چې MTBC strains ډیری وختونه د DNA کوچنۍ ټوټې تبادله کوي، مګر د محدود نیوکلیوټایډ ترتیب توپیر له امله، دا پیښې لاهم نه لیدل کیږي.
مایکوباکټیریم بوویس د څارویو (په عمده توګه غواګانو) څخه تر ټولو عام ترلاسه شوی MTBC غړی دی، که څه هم دا د آزادې ساحې او کټارو شوي وحشي څارویو څخه هم جلا کیدی شي 4,22,23,24. ایم. بوویس په پنځو لویو کلونل کمپلیکسونو کې رامینځته شو [اروپایي 1 (Eu1)، اروپایي 2 (Eu2)، اروپایي 3 (Eu3)، افریقایي 1 (Af1) او افریقا 2 (Af2)]، د سپولیګوټایپینګ پروفایل له مخې، ځانګړي حذفونه او واحد نیوکلیوټایډ پولیمورفیزمونه (SNPs) 25، 26، 27، 28، 29 په ځانګړو جینونو کې. دا کلونل کمپلیکسونه د مایکوباکټیریم بوویس نفوس متنوع جوړښت او د جغرافیایي سیمو سره د هغې تړاو ښیې. برسېره پردې، د زیمپیل او همکارانو لخوا ترسره شوي وروستي WGS کار (2020) د مایکوباکټیریم بوویس د SNP پر بنسټ یو فیلوجیني ډیزاین کړ، چې له 1,900 څخه ډیر جینومونه لري، دا په ګوته کوي چې لږترلږه څلور مختلف نسبونه شتون لري (د Lb1 څخه Lb1 څخه Lb4 نومول شوي)، دوی په بشپړ ډول د مخکې تعریف شوي کلونل کمپلیکس سره مطابقت نلري، که څه هم جغرافیایي ځانګړتیا هم تایید کیدی شي 30. دې لیکوالانو د فیلوجیني او مالیکولر نیټېنګ توپیر تحلیل ترسره کړ، مګر د بیا ترکیب مطالعه یې نه کړه 30.
د مختلفو مالیکولي تخنیکونو په کارولو سره مخکیني کار، لکه سپولیګوټایپینګ، MIRU-VNTR (د مایکوباکتیریل انټرسپرسډ ریپیټ یونټ-متغیر ټنډم ریپیټ نمبر)، او وروستي SNP ټایپینګ د M. bovis strains 31,32,33, 34,35 ترمنځ د جینیاتي تنوع یوه ټاکلې کچه څرګنده کړه. د جینیاتي تغیر توپیر د ناروغۍ ایپیډیمولوژی مطالعې کې یو مهم وسیله ګرځیدلی، کوم چې د رنځپوهنې، ویروس او د ناروغۍ لیږد ژور پوهیدو لپاره ګټور دی. د WGS میتود ظهور د مایکوباکتیریم بویس جینوم لخوا د مختلفو کوربه او ایپیډیمولوژیکي سناریوګانو سره د تطابق او دوام په پروسه کې د تکاملي چلولو عواملو څرګندولو امکان چمتو کوي.
په دې کار کې، موږ د مختلفو مایکوپلاسما بوویس ډیټاسیټونو (n=70) په اړه د پرتلیزې جینومیک تحلیل څخه کار اخلو، په شمول د مختلفو کلونل کمپلیکسونو څخه جلا شوي، د مایکوپلاسما بوویس د ارتقايي پروسې په اړه بصیرت ترلاسه کولو لپاره، په ځانګړې توګه د فایلوجینیټیک اړیکو او بیا یوځای کیدو پیښو حل کولو لپاره. د دې تحلیل د ضمیمې په توګه، د پرتګال 31,36 کې د یو ښه مشخص شوي څو کوربه نري رنځ سیمې څخه ترلاسه شوي د M. بوویس جلا شوي (n = 42) فرعي ډیټا سیټ نور هم وپلټل شو ترڅو غیر پیژندنه معلومه کړي. د حس (dN) او مترادف (dS) نیوکلیوټایډ بدیلونو ترمنځ د نسبي تناسب توازن، او همدارنګه په ادب کې ذکر شوي ځانګړي جینومونو ارتقايي ونډه، دوی 37,38 دي چې د MTBC پلرونو لخوا د HGT له لارې ترلاسه شوي، او د 3R (DNA ترمیم، نقل، او بیا یوځای کیدو) سیسټم جین اجزا 39 کوډ کوي. د HGT له لارې ترلاسه شوي جینونه غوره کړئ ځکه چې دوی ممکن د لرغونو پولیمورفیزمونو استازیتوب وکړي، نو تمه کیږي چې دوی ممکن د مترادف بدلونونو لوړه تناسب ولري. هغه جینونه چې په 3R سیسټم کې شامل دي غوره شوي وو ځکه چې د M. tuberculosis strains په اړه پخوانیو کارونو د عمومي منفي/پاکولو انتخابونو ته اشاره وکړه چې په دې جینونو کار کوي، او دوی ممکن په ارتقا کې مهم رول ولوبوي 39. د دې کار بل هدف د بیا تنظیم کولو پیښو شتون اټکل کول دي. د دې دلیل لپاره، په پام کې نیولو سره چې زموږ د پرتګال څخه ډیټاسیټ یوازې د اروپایی کلون کمپلیکس 2 جینومونه او هغه ډولونه لري چې کلون کمپلیکس یې نه دی ټاکلی، موږ پریکړه وکړه چې په عامه توګه شتون لرونکي جینوم ډیټا شامل کړو ترڅو په پای کې د ټولو کلون کمپلیکسونو استازی ترلاسه کړو، او د پایلو پیاوړتیا او پراخوالی ښه کړو.
د پرتګالي انډیمیک څو کوربه نري رنځ صحنې څخه ۴۲ نوي ترتیب شوي مایکوپلاسما بوویس جینومونه (لاندې جزئیات)، چې مخکې د ایپیډیمولوژیکي لید څخه مشخص شوي وو ۳۶، د دې کار مرکز دي. په پام کې نیولو سره چې د پرتګال څخه د معلوماتو سیټ یوازې د اروپایی ۲ کلون کمپلیکسونو او سټرینونو استازي لري پرته له ټاکل شوي کمپلیکسونو، په عامه توګه شتون لرونکي د بشپړ جینوم ترتیب کولو ډیټا اضافه شوې ترڅو د معلوماتو سیټ پراخ کړي چې پکې د M. bovis کلون کمپلیکسونو ټول استازي شامل دي. له همدې امله، په دې کار کې د بشپړ جینوم ترتیب کولو ډیټا درې سرچینې کارول شوي: بشپړ/مسوده د جینوم اسمبلۍ، تر ۱۰ پورې سکفولډونه چې په NCBI (د بایو ټیکنالوژۍ معلوماتو ملي مرکز) کې زیرمه شوي (n = 15 جلا شوي)؛ په SRA کې زیرمه شوي (د ترتیب لوستلو آرشیف د Illumina fastq فایل) د M. bovis کلونونو پیچلي تنوع استازیتوب کوي (n = 12 جلا شوي) 30؛ او د پرتګال څخه ۴۲ نوي ترتیب شوي جینومونه. مایکوباکټیریم بوویس BCG (Bacille Calmette-Guerin) د NCBI لټون څخه ایستل شوی و. د M. bovis AF2122/97 معمولا د حوالې جینوم په توګه کارول کیږي ترڅو په ډیټاسیټ کې شامل شي. د افریقایي 1 کلونینګ کمپلیکس لخوا نمایندګي شوي د ټول جینوم ترتیب عامه نه شتون له امله، او د Af2 او Eu1 د استازو سټرینونو څخه د جینومونو لږ شمیر له امله، د SRA لخوا چمتو شوي اصلي ترتیب معلومات په دې قضیو کې کارول شوي. د زیمپیل او د هغه همکارانو (2020) کار د پورته ذکر شوي کلونینګ کمپلیکس څخه د جینوم پیژندلو کې مرسته وکړه او د ډیټا سیټ کې د شاملولو لپاره د مایکوباکټیریم بوویس غوره کولو کې مرسته وکړه. د Eu3 لپاره، یوازې یو ډول جینوم تشریح شوی (برینجر او نور، 2020)، نو هغه جینوم چې موږ پکې شامل یو د Eu3 کمپلیکس جلا استازی دی.
په نړیواله کچه، پدې معلوماتو سیټ کې د 70 غواګانو M. bovis شامل دي چې د 8 کوربه ډولونو څخه جلا شوي، چې له 1985 څخه تر 2016 پورې په 12 هیوادونو کې ویشل شوي. 36 ډولونه د Eu2 په توګه ټاکل شوي، 7 ډولونه Eu1 دي، 1 ډولونه Eu3 دي، 3 ډولونه Af1 دي، 4 ډولونه Af2 دي او 19 د کوم کلونل کمپلیکس سره تړاو نلري (لاندې جزئیات). پدې څیړنه کې کارول شوي د مایکوباکټیریم بوویس تفصيلي معلومات (د لاسرسي شمیرې په شمول) په جدول 1 او ضمیمه جدول 1 کې ښودل شوي.
د پرتګال د څارویو د نري رنځ د ګرمو ځایونو څخه د مایکوباکټیریم بوویس ۴۲ نوي ترتیب شوي بشپړ جینومونه او د ۱۲ کلونو څخه ډیر وخت لپاره ویشل شوي د دې مطالعې مرکز دی، ځکه چې د ځنګلي ژوند او څارویو د ناروغیو احتمالي سیسټمونه په منظم ډول څارل شوي دي ۳۱،۳۶ (ضمیمه انځور ۱). د راتلونکو پروسیجرونو له مخې، دا ډولونه له ۲۰۰۳ څخه تر ۲۰۱۵ پورې د غواګانو (n = ۱۴)، سره هوسۍ (n = ۱۶) او وحشي خنزیر (n = ۱۲) څخه جلا شوي وو: د سپارښت شوي پروتوکول لارښوونو سره سم څاروي راټول او اداره کړئ د نسج نمونې د OIE ځمکني څارویو په لارښود کتاب کې دي او په سټونبرینک او لوینسټین-جینسن پیروویټ جامد منځني او مایع منځني کې واکسین شوي دي. کلتورونه په ۳۷ درجو سانتي ګراد کې اچول کیږي او وده په اونۍ کې یو ځل لږترلږه د ۱۲ اونیو لپاره معاینه کیږي. کالونۍ په مستقیم ډول د ګلیسیرول محلول کې په -۸۰ درجو کې زیرمه کیږي. په مایکوباکټیریم انتخابي میډیم (میډلبروک 7H9، BD تشخیصات) کې، اصلي آرشیف شوي نمونې د WGS پروګرام د DNA ترلاسه کولو لپاره د ویټرو په یوه واحد ان ویټرو پاسیج کې تیرې شوې. د دې لپاره، د منجمد کلتور سټاک محلول د 5٪ سوډیم پیروویټ او 10٪ ADS (50 ګرامه البومین، 20 ګرامه ګلوکوز، 8.5 ګرامه سوډیم کلورایډ په 1 لیټر اوبو کې) سره په میډلبروک 7H9 کې په 37 درجو سانتی ګراد کې بډایه شو. د 4 اونیو ودې وروسته، میډیم نوي شو او کلتور په منظم ډول تر هغه وخته پورې وڅارل شو تر څو چې وده ونه لیدل شي. حجرات د سینټرفیوګیشن له لارې راټول شول، ګولۍ په 500 µL فاسفیټ بفر شوي مالګین (PBS) کې بیا وځنډول شوه، د 30 دقیقو لپاره په 99 درجو سانتی ګراد کې تودوخه شوه، سینټرفیوج شوه، او سوپرنټینټ په -20 درجو سانتی ګراد کې تر WGS پورې زیرمه شو. ټولې پروسیجرونه د 3 کچې بایو سیفټي تاسیساتو کې ترسره کیږي.
د WGS جوړه شوې جینوم کتابتون د هر DNA نمونې د ځانګړي شاخص په کارولو سره چمتو شوی، او د ترتیب لپاره د Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 نمونې) او HiSeq (2 × 150 pb) (دوه جلا شوي) ټیکنالوژۍ (یوروفینز جینومکس، جرمني) څخه کار اخلي. د جوړونکي لارښوونو سره سم، د جینومیک DNA ترتیب کولو لپاره د دوه اړخیز ماډل ضمیمه سره د Illumina جینوم تحلیل کونکي وکاروئ، او د کتابتون جوړولو لپاره د Illumina څخه د Nextera XT DNA کتابتون چمتو کولو کټ وکاروئ.
د SRA (n = 12) څخه ترلاسه شوي معلوماتو په پام کې نیولو سره، د کلون کمپلیکس پیژندنه د اړونده خپرونې 30، 41، 43 د میټاډاټا په توګه کارول کیدی شي. کله چې بشپړ جینوم په پام کې ونیول شي، د مایکوباکټیریم بوویس AF2122/97 او مایکوباکټیریم بوویس 3601 پرته، کوم چې په ترتیب سره د Eu1 او Eu3 کلونل کمپلیکس 25، 29 پیژندل شوي غړي دي، دا د مایکوباکټیریم ټوبرکلوسس H37Rv (NCBI د لاسرسي شمیره NC_000962.3) بشپړ جینوم سره ورته دی. د جینوم سمون د MAFFT (د امینو اسید یا نیوکلیوټایډ ترتیب څو اړخیز سمون پروګرام، نسخه 7.458) او پیرامیټر -addfragments48 په کارولو سره ترسره کیږي. بیا، د مختلفو کلونل کمپلیکسونو نشتوالي او/یا د SNP ځانګړتیاو شتون لپاره لټون وکړئ.
نوی ترتیب شوی مایکوباکټیریم بوویس (n = 42) او د راټول شوي جینوم مسودې اصلي لوستل (n = 3) د vSNP پایپ لاین له لارې پیچلي د مایکوباکټیریم ټوبرکلوسس H37Rv حوالې جینوم سره سمون لري او د مختلفو کلونونو د حذف کولو او/یا SNP ځانګړتیاو شتون یوه پلټنه ترسره شوه.
د ځانګړتیاوو نشتوالي او/یا د SNP او سپولیګوټایپینګ پروفایلونو شتون/نه شتون څخه معلومات راټول کړئ ترڅو اړونده کلونل کمپلیکس ته جینومیک معلومات ورکړئ. د څلورو مسودو غونډو لپاره، د سپولیګوټایپینګ پروفایل نشي اټکل کیدی، نو دوی د "پیچلیتوب نه" ګروپ کې شامل دي.
د بایو انفارمیټکس کاري جریان چې د دې کار وروسته تعقیب کیږي د نوي راټولولو او نقشه کولو څخه د حوالې ستراتیژۍ ته پیل کیږي، چې هدف یې د بیا یوځای کیدو پیښو او ځانګړي جینوم پولیمورفیزمونو سپړنه ده. شکل 1 د تعقیب شویو ګامونو فلوچارټ چمتو کوي. د بیا یوځای کیدو تحلیل لپاره، ټول جینومونه د انفرنسونو او اړوند شاخصونو قوي والي زیاتولو لپاره کارول کیږي.
د جینوم د اجماع ترتیبونو په تولید کې د غلطیو کمولو لپاره، موږ لومړی د نوو اسمبلۍ ترلاسه کړه، او بیا یې د کور څو اړخیز سمونونه ترلاسه کړل. د یونیسایلر پایپ لاین اوس مهال په https://github.com/rrwick/Unicycler49 کې شتون لري او د 54 ترتیب شوي جینومونو (42 نوي ترتیب شوي او 12 فاسټ کیو فایلونه چې د SRA څخه ترلاسه شوي) د نوو اسمبلۍ ترسره کولو لپاره کارول کیږي. په لنډه توګه، د پیل څخه د راټولولو دمخه، د لوستلو کیفیت تحلیل په FastQC نسخه 0.11.7 (https://github.com/s-andrews/FastQC)، او Trimmomatic نسخه 0.36 (اختیار "د لوستلو څخه اډاپټرونه او نور د رڼا ځانګړي ترتیبونه پرې کول" او "د لوستلو له پای څخه اساسات پرې کړئ، که چیرې د 20 د حد کیفیت څخه ټیټ وي" پلي شي) (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic) 50 کې ترسره شو. بیا، د جینوم اسمبلۍ لپاره SPAdes optimiser49 کارول شوی و، او د Pilon نسخه 1.1851 د اسمبلۍ وروسته اصلاح لپاره کارول شوی و. د غلط اسمبلۍ څخه د مخنیوي لپاره د محافظه کار پل کولو حالت غوره شوی و، او د k-mer اندازه د لوستلو اوږدوالي د 20٪ او 95٪ ترمنځ وپلټل شوه او غوره شوه. د SPAdes لارښوونې تعقیب کړئ او د لوستلو اندازه په پام کې ونیسئ، د 300 bp څخه کوچني کانټیګونه حذف کړئ، او د 52 د لوستلو ژوروالي پوښښ کټ آف 20 رامینځته کړئ. د نوو اسمبلۍ ستراتیژۍ کې، جینومیک سیمې لکه خورا تکراري پرولین-ګلوټامیټ (PE) او پرولین-پرولین ګلوټامیټ (PPE) پارالوګونه لرې نه شول.
د ډی نوو اسمبلۍ کیفیت د QUAST پایپ لاین (http://quast.sourceforge.net/quast.html) له لارې ارزول کیږي، کوم چې د کانټیګ او M. bovis AF2122/97 حوالې جینوم (NCBI د لاسرسي شمیره LT708304.1) نقشه کولو (د کیفیت پیرامیټرو لپاره ضمیمه جدول 1 وګورئ) نوي کول اسانه کوي.
د vSNP پایپ لاین (https://github.com/USDA-VS/vSNP) په مرسته، د ایلومینا سیکوینسنګ څخه د نوي ترتیب شوي M. bovis FASTQ فایل د M. bovis AF2122/97 حوالې جینوم (LT708304.1)) سره پرتله کیږي. د جینوم تحلیل وسیلې (GATK) 53، 54، 55 د غوره عمل سپارښتنو سره سم د بیا کیلیبریشن لپاره معیاري فلټر پیرامیټرې یا د متغیر ډله ایز سکورونه پلي کړئ. پایلې د 150 او AC = 2 د ټیټ SAMtools ډله ایز سکور په کارولو سره فلټر شوي. همدارنګه د ککړتیا د ردولو لپاره د لوستلو چک کولو لپاره کریکن (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) وکاروئ. زموږ په کار کې د ترتیب ستراتیژیو نقشه کولو لپاره کارول شوی vSNP پایپ لاین د تعریف شوي SNPs او اهدافو لړۍ معاینه کوي، او د مخلوط انتان سناریوګانې هم خارجوي. د لوستل شوي جینوم پوښښ د 99٪ څخه غوره دی (ضمیمه جدول 1).
د نقشې تېروتنو او غلط SNPs څخه د مخنیوي لپاره، په لاندې قضیو کې یو ډول فلټر کړئ: (1) دا د 20 څخه کم لوستلو لخوا ملاتړ کیږي، (2) دا د 0.9 څخه کم فریکونسۍ سره موندل کیږي، (3) دا لږترلږه په یو سټرین کې دی، مګر لږترلږه په بل سټرین کې تشې شتون لري. د مدغم جینومیک لیدونکي (IGV) نسخه 2.4.19 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 د SNPs او موقعیتونو د نقشې کولو یا سمون ستونزو سره د لید تصدیق کولو لپاره کارول شوی و. څرنګه چې پرولین-ګلوټامیټ (PE) او پرولین-پرولین ګلوټامیټ (PPE) جینونه خورا نقل شوي دي او د څو جین کورنۍ برخه دي، دوی په اسانۍ سره د ایلومینا ترتیب او غلط نقشه کولو لخوا غلط فهم کیږي، نو دوی غوره دي. د مایکوباکټریل بایو انفارمیټکس کاري فلو د نري رنځ کمپلیکس غړي لرې کړل کله چې د SNPs تایید لپاره د ترتیب کولو نقشه کولو ستراتیژي کاروي. له همدې امله، موږ د تحلیل څخه PE/PPE جینونه او انډیلونه فلټر کړل.
د بوویلیسټ (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) په وینا، ټول SNPs په فعال کټګوریو ویشل شوي دي. د SnpEff پایپ لاین (https://pcingola.github.io/SnpEff/) د SNP پایلو (مترادف یا غیر مترادف بدلونونو) د اټکل کولو لپاره کارول کیږي. د مایکوباکټیریم بوویس AF2122/97 جینوم (LT708304.1) یو نوی ډیټابیس جوړ کړ.
د کور جینوم څو اړخیز سمون د Parsnp v1.2 په کارولو سره ترسره شو، چې اوس مهال په https://github.com/marbl/parsnp57 کې شتون لري، د 69 بشپړ جینومونو/ډرافت اسمبلۍ (د اختیار -c سره) او M. bovis AF2122/97 (LT708304.1) په کارولو سره د حوالې په توګه کارول کیږي. څلور اصلي څو اړخیز سمونونه ترسره شول: یوازې د Eu2 کلونینګ کمپلیکس غړي (n = 37)، د اروپایی کلونینګ کمپلیکس ټول غړي (n = 44)، د اروپایی او افریقایي کلونینګ کمپلیکس د جنکشن نقطه (n = 51) په ګډون، او پدې څیړنه کې ټول مایکوباکټیریم بوویس شامل دي (n = 70).
د Parsnp لخوا رامینځته شوی اصلي سمون د RAxML په کارولو سره د CIPRES ساینس ګیټ وے v3.3 (http://www.phylo.org/)58 په کارولو سره د اعظمي احتمال (ML) فایلوجینیټیک ونې د اټکل لپاره کارول کیږي، او 1000 لارښود شوي نقلونه ترسره کوي.
د بیا یوځای کېدو پیښو د شتون د چک کولو لپاره درې مختلف الګوریتمونه او بایو انفارمیټکس وسایل کارول کیږي: SplitsTree4 سافټویر، Gubbins (د نیوکلیوټایډ ترتیبونو کې د بیا یوځای کېدو له لارې بې طرفه نسب) پایپ لاین، او RDP4 (د بیا یوځای کېدو کشف پروګرام، نسخه بیټا 4.101) سافټویر.
د ویشل شوي تجزیې طریقه چې په SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59 کې پلي شوې د احصایوي تایید لپاره د Phi ازموینې په کارولو سره د بې ریښې فایلوجینیک شبکې محاسبه کولو لپاره کارول کیږي، او د اهمیت حد p = 0.05 دی. د Parsnp اصلي څو اړخیز تحلیل د ان پټ په توګه کارول کیږي، او د ویشل شوي تجزیې د شبکې معیار په توګه احساس کیږي.
د ګوبینز پایپ لاین v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60) د مایکوباکټیریم بوویس باندې د بیا ترکیب اغیزې ارزولو لپاره د بلې لارې په توګه د ډیفالټ پیرامیټرو سره کار کوي. په پایپ لاین کې پلي شوی الګوریتم اړونده کلون نسب بیا رغوي. زموږ د معلوماتو سیټ بشپړ جینوم/مسوده اسمبلۍ او د حوالې جینوم (د غواګانو بوویډ AF2122/97، LT708304.1) یو بل سره تړاو لري؛ او د ونې په هره څانګه کې د SNP موقعیت سکین کړئ ترڅو د SNP کلستر کشف کړئ چې د بیا ترکیب پیښې استازیتوب کوي. د څانګې صفر فرض کړئ چې د بیا ترکیب هیڅ پیښه شتون نلري، پدې معنی چې هغه SNPs چې په څانګه کې پیښیږي باید په مساوي ډول وویشل شي. د Parsnp څخه اصلي څو اړخیز سمون او د RAxML څخه غوره نمرې شوي ML ونې د ان پټ فایلونو په توګه کارول کیږي.
په پای کې، د ګوبینز پایپ لاین لخوا وړاندیز شوي د بیا تنظیم کولو پیښې تایید لپاره، په RDP467 (RDP61، GENECONV62، Bootscan63، Maxchi64، Chimaera65 او SiScan66) کې پلي شوي شپږ الګوریتمونه د ډیفالټ ترتیباتو لاندې د Parsnp اصلي څو سمونونو ته پلي کیږي. موږ پریکړه وکړه چې په RDP4 کې پلي شوي لږترلږه درې الګوریتمونه باید په دوامداره توګه د هر بیا ترکیب پیښې تصدیق کولو لپاره یو مهم سیګنال وښيي.
په پام کې نیولو سره چې ګوبینز او RDP سافټویر دواړه د 500 bp پورې کړکۍ کې د کور څو اړخیزو سمونونو په چک کولو سره د بیا ترکیب سیګنالونه لټوي، او دا تاییدوي چې د نوي اسمبلۍ په جریان کې د PE/PPE جینونو شاملول به د موندل شوي بیا ترکیب سیګنالونو سره مداخله ونکړي، نور تحلیل د هومولینیریت لخوا ترسره کیږي د جین شاوخوا وګورئ چې د بیا ترکیب پیښې پیژني. د بشپړ جینوم په کارولو سره سنلینیر نقشه د MAUVE-multi-genome alignment (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) په کارولو سره جوړه شوې ترڅو د ځایی جینوم لیږد یا انعطاف خارج کړي. سربیره پردې، ټول جینوم د SyntTax ویب سرور (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) له لارې د امینو اسید ترتیب په اړه د هومولینیریت تحلیل ترسره کولو لپاره کارول شوی و.
د پرتګالي څو کوربه توبرکلوز سیسټم څخه ترلاسه شوي د جینوم ډیټا سیټ ژور تحلیل دا دی چې په ادبیاتو کې ذکر شوي جینونو پولیمورفیزم وڅیړل شي. دا جینونه 37،38 دي او د جین کوډ کول 3R د MTBC پلرونو لخوا د HGT (DNA ترمیم، نقل او بیا ترکیب) سیسټم اجزاو 39 له لارې ترلاسه شوي. د جین تنوع او نیوکلیوټایډ تنوع (π) او د تاجیما د D غیر جانبدار ازموینې پیرامیټر ان پټ محاسبه کولو لپاره د ClustalX v2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) وکاروئ او DnaSP v6.12.03 (http://www.ub.edu/dnasp/) وکاروئ.
د 69 مایکوپلاسما بوویس جلا کولو او حوالې جینومونو پراساس اعظمي احتمال (ML) فایلوجینټیک ونې ترلاسه شوې (شکل 2A). د واحد جین پر بنسټ ونو یا څو لوکس پر بنسټ ونو سره پرتله کول، دا ستراتیژي د ډیرو قوي ونو نسل ته اجازه ورکوي چې د ټول جینوم تغیر نه نیسي او له همدې امله د 68,69 ډولونو ترمنځ د توپیر کولو ټیټ وړتیا ښیې. د ML ونې توپولوژیکي جوړښت معمولا د کلونونو پیچلي طبقه بندي سره مطابقت لري. د Eu2 جینوم په یوه څانګه کې کلستر شوی، او د Af1 جینوم هم یوځای کلستر شوی (شکل 2A). پایله د مایکوباکټیریم بوویس د پیژندل شوي ارتقايي اړیکو سره هم مطابقت لري، دا ده چې د Eu1 غړي او د نورو ټولو کلونل کمپلیکسونو او جینومونو څخه جوړ شوي ګروپ ترمنځ لوی توپیر شتون لري، مګر د کلونل کمپلیکس 30 مشخص شوی نه دی. د کلونل کمپلیکس او په فایلوجینیټیک ونې کې لیدل شوي اړیکې ترمنځ کوچنۍ ناانصافي د دې حقیقت له مخې تشریح کیدی شي چې کلونل کمپلیکس د ځانګړو جینومیک سیمو پراساس تشریح شوی، پداسې حال کې چې فایلوجینیټیک ونې د اصلي جینومونو د څو سمونونو پراساس دی چې ټول جینوم استازیتوب کوي.
د فایلوجینټیک ونې اعظمي احتمال (GTR) د مایکوباکټیریم بوویس جینوم د اصلي جینوم سمون پراساس جوړ شوی چې د (A) څخه مخکې او (B) د بیا ترکیب سایټ له لرې کولو وروسته. د څانګو رنګونه د مایکوباکټیریم بوویس کلون کمپلیکس استازیتوب کوي: اروپا 1 ارغواني دی، اروپا 2 سور دی، اروپا 3 نیلي دی، افریقا 1 نارنجي دی، او افریقا 2 شنه دی. ونې ریښې لري او پیمانه ته راښکته کیږي، او د څانګې اوږدوالی د هر سایټ لپاره د بدیل په توګه اندازه کیږي.
د مایکوباکټیریم توبرکلوز کمپلیکس د کلوني ارتقا په توګه تشریح شوی، او ډیری شواهد چې د کلونو په اوږدو کې راټول شوي د دې نظر ملاتړ کوي چې روانې HGT او بیا ترکیب پیښې به د MTBC15,17,18 کشف وړ کچې کې نه پیښیږي.
پخوانیو کارونو ښودلې چې ممکن د MTBC ډولونو ترمنځ محدود بیا ترکیب وي20,21، پداسې حال کې چې نور د اندازه کولو وړ بیا ترکیب پیښو پیژندلو کې پاتې راغلي دي70,71. دا مسله د مایکوباکټیریم بوویس په تمرکز سره بیا بحث وکړئ، کوم چې د تیرو کارونو څخه توپیر لري چې یوازې مایکوباکټیریم توبرکلوز 70,71 په پام کې نیسي؛ یا په بشپړ ډول MTBC په پام کې ونیسئ، نږدې هیڅ M. بوویس 20 استازیتوب نه کوي؛ یا یوازې د محدودو څارویو برخې په پام کې ونیسئ. د مایکوباکټیریم ډیټاسیټ، پدې کار کې، ټول 70 ډولونه شتون لري، چې د ټولو کلونل کمپلیکسونو استازیتوب کوي، د بیا ترکیب لپاره سکرین کولو لپاره کارول کیږي. د معلوماتو سیټ د څلورو مجموعي کچو سره سم اندازه شوی: (1) Eu2 غړي، (2) ټول اروپایی کلون کمپلیکس غړي (یعنې اروپا)، (3) اروپایی او افریقایي کلون کمپلیکس (Eu + Af) او (4) ټول معلومات ټولګه (په شمول د جینومونو چې دمخه تشریح شوي په کوم کلونینګ کمپلیکس کې شامل ندي).
د دې فرضیې د لا مطالعې لپاره، د جینومونو ترمنځ د بیا یوځای کیدو پیښو د نشتوالي ارزولو لپاره د ویشلو-تخریب شبکه ترسره شوه، ځکه چې دا طریقه کولی شي د افرادو ترمنځ د پلرني اړیکو تصور وکړي او متضاد فیلوجینټیک سیګنالونه ښکاره کړي. په تحلیل کې ټولو څلورو ډیټا سیټونو په شبکه کې د لوپونو شتون تایید کړ (یعنې، هغه سیمې چې په یوه ونې کې نه سره یوځای کیږي)، مګر د فای ازموینه هیڅ احصایوي ملاتړ نلري (Eu2، p = 0.0956؛ اروپا، p = 0.1637؛ Eu + Af p = 0.2774؛ د ټول ډیټا سیټ p = 0.2451)، کوم چې د بیا تنظیم کولو پیښو شتون لپاره ضعیف شواهد وړاندې کوي (شکل 3A-D).
په اروپا کې دوه جینومونه (n = 37) (A)، اروپایي جینومونه (n = 44) (B)، اروپایي او افریقایي جینومونه (n = 51) (C) او ټول معلوماتي سیټ (n = 70) (D).
د دې تحلیل وروسته، او په ټولو شبکو کې د دوراني مشاهدو په پام کې نیولو سره، د ګوبینز پایپ لاین کې پلي شوي بیارغونې الګوریتم د کلونل نسب بیارغونې او د M. bovis جینوم باندې د بیا ترکیب اغیزې اټکل بشپړولو لپاره پلي شو. د بیا ترکیب پیښو مجموعي شمیر اټکل کړئ، چې ډیری یې په ټرمینل څانګو کې پیښ شوي (یعنې په یوه واحد جینوم کې) (جدول 2). دا شاخصونه د ټول ډیټا سیټ تسلسل ښیې او په ګوته کوي چې د بیا ترکیب پیښو فریکوینسي د بدلونونو څخه 200 څخه تر 300 ځله ده. یوځل چې د rho/theta پیرامیټر د بیا ترکیب او نقطې بدلونونو نسبي نرخونه په څانګه کې د 0.0037 او 0.0056 ترمنځ ښکاري (جدول 3). په دې وروستیو کې، د 38 M. bovis strain خپور شوی کار د دې ډیټاسیټ کې ترلاسه شوي په پرتله د rho/theta لوړ ارزښت (rho/theta = 0.1) ښودلی، مګر د پټاني او همکارانو کار د بیا یوځای کیدو پیرامیټرو د استنباط لپاره د حوالې پر بنسټ اسمبلۍ کارولې، د اسمبلۍ پروسې له امله د طرزالعمل توضیحات، د ټرمینل څانګې کې د احتمالي بیا یوځای کیدو پیښو کثرت سره تړاو لري.
بل، r/m پیرامیټر د بیا یوځای کیدو او بدلون معرفي کولو تنوع تناسب استازیتوب کوي، او د هغې اوسط ارزښت د 0.025 او 0.037 ترمنځ دی، دا په ګوته کوي چې د بدلونونو په پرتله، بیا یوځای کیدل د M. bovis (جدول 3)) په جینیاتي تنوع باندې ټیټ عمومي اغیزه لري. د پراخې پرتله کولو لپاره، د 23 جینومونو څخه جوړ شوي MTBC ډیټاسیټ لپاره د r/m پیرامیټر اټکل کولو لپاره ورته میتود کارول شوی و، چې اوسط ارزښت یې 0.48620 ښودلی، پداسې حال کې چې د پټان او همکارانو د 38 M. bovis ډیټاسیټ لپاره، دا ثابته کړه چې اوسط ارزښت 0.98 دی. په لومړۍ څیړنه کې، د 23 جینومونو څخه یوازې دوه د M. bovis (M. bovis BCG او د حوالې فشار) په کار کې شامل وو، نو ترلاسه شوی ارزښت ممکن د M. tuberculosis جینوم د ډیر څرګندیدو له امله تعصب وي. په دوهم راپور کې، تحلیل شوي مایکوباکټیریم بوویس نفوس په عمده توګه د متحده ایالاتو او څارویو کوربه څخه ترلاسه شوي. برعکس، زموږ په ډیټا سیټ کې، ډیر جغرافیایي موقعیتونه او کوربه ډولونه ښودل شوي، او جینومونه چې په مختلفو کلونل کمپلیکسونو کې ګروپ شوي د مختلف نفوس جینیاتي ځانګړتیاو سره هم کارول کیږي، پدې توګه د نفوس ژوره او پراخه پوهه ترلاسه کوي. زموږ د ډیټا سیټ سره ترلاسه شوي توپیر r/m اوسط ارزښت د دې مفکورې سره مطابقت لري چې د بیا یوځای کیدو درجه د ورته ټیکسونومیک ډولونو ته ټاکل شوي نسبونو ترمنځ خورا توپیر لري، نو دا پایلې ښیي چې د M. bovis کلون کمپلیکس ممکن د بیا یوځای کیدو توپیرونه وښيي. اغیزه هم د ډیډیلوټ او میډن لخوا وړاندیز شوې ده72. سره له دې، د M. bovis جینومونو لوی شمیر شاملولو سره د دې ډیټا سیټ د پام وړ پراخول به د دې ټکي نور وضاحت ته اجازه ورکړي. دواړه r/m او rho/theta پیرامیټرونه د څانګو ترمنځ تغیر ښیې، او دا پایله د نورو باکتریا ډولونو راپورونو سره مطابقت لري72,73.
په پای کې، د ګوبینز پایپ لاین لخوا پیژندل شوي د بیا تنظیم کولو پیښو تایید لپاره، په RDP4 سافټویر کې شپږ مختلف الګوریتمونه کارول شوي ترڅو په خپلواکه توګه مختلف اصلي څو پرتله کولو ازموینه وکړي. په نړیواله کچه، د ګوبینز لخوا پیژندل شوي د نیمایي څخه لږ پیښې د RDP4 لخوا تایید شوي (جدولونه 4 او 5). د ټول معلوماتو سیټ په پام کې نیولو سره، درې د بیا ترکیب پیښې تایید شوې، دوه یې داخلي نوډونه شامل دي او بل یې په ټرمینل څانګه کې یو واحد جینوم شامل دی، د کوم لپاره چې کلونل کمپلیکسونه نشي ټاکل کیدی (جدولونه 4 او 5). په ټرمینل څانګو کې د پیښو پیژندنه ممکن دا په ګوته کړي چې بیا ترکیب لاهم په معاصر M. bovis strains کې روان دی یا پایله یې غلطه شوې ده 70. پدې فرضي بیا ترکیب سیمه کې، نږدې 20٪ موقعیتونه غیر تعریف شوي نیوکلیوټایډونه (N) لري، پدې توګه د بیا ترکیب سیګنال اغیزه کوي (ضمیمه شکل 2). برسېره پردې، دا سیمه د rrs جین اغیزه کوي، د 16S ریبوسومل RNA کوډ کوي چې تمه کیږي خورا خوندي وي، نو دا احتمالي بیا ترکیب سیګنال ممکن د ترتیب غلطیو یا غلط تنظیم پایله وي. بیا د Mb0003 او مایکوباکټیریم بویس AF2122/97 ترمنځ د جینوم ټول سمون ترسره شو، او د غیر تعریف شوي نیوکلیوټایډونو او SNPs شتون تایید شو، نو د غلط سمون پورې اړوند احتمالي ستونزې د دې کار کې پلي شوي بیولوژیکي معلوماتو له امله نه وې د پروګرام زده کولو وروسته څرګندې شوې.
د داخلي نوډونو د بیا ترکیب په سیمو کې هیڅ تشې یا نا تعریف شوي نیوکلیوټایډونه ونه موندل شول (شکلونه 4 او 5). د دې پیښو په اړه، یو یوازې Eu2 جینوم لري او pks12 جین اغیزه کوي، کوم چې د احتمالي پولیکیټایډ ترکیب کوډ کوي؛ پداسې حال کې چې بل په Eu1 جینوم کې ثبت شوی او د نار ایکس جین اغیزه کوي چې د احتمالي نایټریټ ریډکټیس کوډ کوي (جدول 4). په عموم کې، د بیا ترکیب تحلیل ښیې چې د احصایوي ملاتړ سره د بیا ترکیب محدود شمیر ټوټې شتون لري، او اټکل شوي شاخصونه ښیې چې بیا ترکیب د M. bovis نسب باندې ټیټ اغیزه لري. د بیا ترکیب سیګنال تمه کیږي چې ټیټ وي، مګر دا مهمه ده چې د ریښتیني ارتقا سیګنال د شالید شور څخه توپیر کړئ، کوم چې یو ننګونکی کار دی. د حوالې پر بنسټ اسمبلۍ او د بې مطابقت ستونزو 70، 71 لخوا معرفي شوي شور سیګنال کمولو لپاره، د بشپړ جینوم پرته نور ټول له پیل څخه راټول شوي وو، او د اسمبلۍ کیفیت د QUAST پایپ لاین تحلیل لخوا چیک او ډاډمن شو (ضمیمه جدول 1). برسېره پردې، د ټولیزې سروې د پیاوړتیا او دقت چمتو کولو لپاره د اضافي تحلیلونو لړۍ ترسره شوه. له همدې امله، د narX او pks12 جینونو د ترتیب کیفیت د مایکوباکټیریم بوویس AF2122/97 په وړاندې د لوستلو نقشې په واسطه ارزول شوی و. د بیا ترکیب په سیمه کې د SNP وړاندیز شوی موقعیت د میتود برخې کې ذکر شوي معیارونو پلي کولو سره تایید شو (لږترلږه 20 لوستل او 0.9 بدلون فریکونسي). د narX جین پولیمورفیزم په دوه جینومونو (Mb1792361 او Mb7240415؛ 2.3٪) او د pks12 جینومونو: Mb0891، Mb1711، Mb1789، Mb1870، Mb17046، Mb1756، او Mb12 جینونو کې په بشپړ ډول تایید شو. په هرصورت، د Mb2043 جینوم لپاره، د اتو پوستونو څخه شپږ یې د لوستلو ژوروالي معیار نه پوره کوي ځکه چې SNP د اعظمي 17 لوستلو لخوا ملاتړ کیږي، کوم چې د 20 د ټاکل شوي کټ آف ارزښت څخه ښکته دی. له همدې امله، د دې جینوم سایټ کې د شپږو جینومونو (8.6٪) بیا ترکیب تایید کیدی شي (شکلونه 4 او 5).
د مایکوباکټیریم بوویس ډیټاسیټ د بیا یوځای کیدو سیمې د سمون مفصل لید د نارکس جین باندې تاثیر کوي چې د نایټریټ ریډکټیس احتمالي کوډ کوي. د داخلي نوډونو د بیا یوځای کیدو په سیمه کې هیڅ تشې یا نا تعریف شوي نیوکلیوټایډونه ونه موندل شول. دا ځانګړې پیښه په Eu1 جینوم کې ثبت شوې ده. د نارکس جین د ترتیب کیفیت د مایکوباکټیریم بوویس AF2122/97 د لوستلو پلاټ کولو سره ارزول شوی. د میتود برخې کې ذکر شوي معیارونو پلي کولو سره د بیا یوځای کیدو په ساحه کې د وړاندیز شوي SNP موقعیت تایید کړئ (لږترلږه 20 لوستل او 0.9 د بدلون فریکونسي). د نارکس جین پولیمورفیزم د Mb1792361 او Mb7240415 (2.3٪) جینومونو کې په بشپړ ډول تایید شوی.
د مایکوپلاسما بوویس ډیټاسیټ د بیا ترکیب سیمې د سمون مفصل لید چې pks12 جین اغیزه کوي. د داخلي نوډونو د بیا ترکیب په سیمه کې هیڅ تشې یا نا تعریف شوي نیوکلیوټایډونه ونه موندل شول. د هغه پیښې په اړه چې د pks12 جین د ممکنه پولیکیټایډ ترکیب کوډ کولو باندې اغیزه کوي، دا یوازې Eu2 جینوم لري. د pks12 د ترتیب کیفیت د مایکوباکټیریم بوویس AF2122/97 د لوستلو نقشې لخوا ارزول شوی. د میتود برخې کې ذکر شوي معیارونو پلي کولو سره د بیا ترکیب په ساحه کې د وړاندیز شوي SNP موقعیت تایید کړئ (لږترلږه 20 لوستل او 0.9 بدلون فریکونسي). د Mb0891، Mb1711، Mb1789، Mb1870، Mb1758، Mb2043، او Mb1960 جینونو پولیمورفیزمونه په بشپړ ډول تایید شوي.
د PE او PPE جینونه تکراري سیمې لري چې د ایلومینا ترتیب او غلط نقشې کولو لخوا په اسانۍ سره غلط لوستل کیږي، نو دوی معمولا د M. tuberculosis غړو د بایو انفارمیټکس کاري فلو څخه یوازې هغه وخت حذف کیږي کله چې د نقشې کولو څخه ترتیب ستراتیژي کاروي. پدې کار کې پلي شوي د بیا ترکیب پیښو استخراج د PE/PPE فلټر کولو پرته د ډی نوو اسمبلۍ پراساس دی. موږ باور لرو چې د SplitsTree، Gubbins پایپ لاین او RDP4 سافټویر له لارې د دریو مختلف تکمیلي میتودونو او الګوریتمونو پلي کولو سره، پلي شوي ستراتیژیانې د غلطۍ سیګنالونو له امله رامینځته شوي بیا تنظیم شوي سیمو پروسس کولو او فلټر کولو لپاره قوي دي. په هرصورت، د SNP کلسترونو پیژندلو لپاره په Gubbins او RDP4 سافټویر کې د PE/PPE جین مداخله خارجولو لپاره، او له همدې امله د بیا ترکیب سیمو پیژندنه چې د narX او pks12 جینونو اغیزه کولو لپاره وړاندیز شوې، د دې جینونو ګاونډیتوب معاینه شو (ضمیمه انځور 3-5). په M. bovis AF2122/97 کې، د narX جین د narK2 او Mb1764c لخوا جلا شوی، پداسې حال کې چې pks12 د Mb2075c او Mb2073c لخوا محاصره شوی دی (ضمیمه شکل 3-5). د بشپړ جینوم د MAUVE سنلاین نقشې په کارولو سره رامینځته شوی نقشه د جین ترتیب ساتنې او بیا تنظیم کولو په اړه معلومات چمتو کوي، څلور کولینیر بلاکونه ښیې، او د جینوم لیږد یا انورسیشن هیڅ نښې نلري. سربیره پردې، د امینو اسید ترتیب سره د تکمیل تحلیل په ټولو بشپړ جینومونو کې هومولوژي ثابته کړه، او د narX یا pks12 په نږدې سیمو کې هیڅ PE/PPE ونه موندل شو. د narX لپاره، یو جینوم (Mb0030) د مترادف ټیټ نمره لري ځکه چې د narX جین د دوو ټوټو په توګه پیژندل شوی و (ټوټې 1891 او 1890). د pks12 لپاره، د ورته والي له امله، Mb0030 او Mb003 د ټیټ سنلینیرټي نمرې ښودلې، پداسې حال کې چې pks12 په ترتیب سره په دوه او دریو ټوټو کې پیژندل شوی، چې د پروټین مختلف ډومینونه استازیتوب کوي (ضمیمه شکل 3-5). د دې معلوماتو په پام کې نیولو سره، او ګوبینز او RDP4 سافټویر دواړه تحلیل ترسره کوي، په کړکۍ کې د اعظمي 500 bp اصلي څو سمون چیک کوي، موږ تایید کړه چې د PE/PPE جین به د بیا ترکیب سیګنال سره مداخله ونکړي چې narX او pks12 اغیزه کوي.
که څه هم په دې ډیټا سیټ کې کشف شوي بیا ترکیب سیګنالونه ممکن پاتې وګڼل شي، دا ریښتیا ده چې په ایم بویس کې بیا ترکیب رد نه شي کیدی، نو دا باید د نورو تحلیل موضوع وي، په کوم کې چې د مختلفو ایپیډیمولوژیکي سناریوګانو څخه ټول جینومونه په مهم ترتیب سره ترتیب شوي دي.
د بیا ترکیب اصلاح څخه مخکې او وروسته ترلاسه شوي ML فایلوجینیټیک ونو پرتله کول (شکل 2A، B) د اټکل شوي فایلوجینیټیک اړیکو کې د پام وړ بدلونونو لامل نه شو، او د M. bovis strains په ورته ګروپ کې کلستر شوي وو.
د M. bovis AF2122/97 د حوالې جینوم سره د 42 نوي ترتیب شوي M. bovis لوستلو نقشه کولو وروسته، د SNP سمون چې 1816 پولیمورفیک موقعیتونه لري ترلاسه شو. ډیری SNPs (87.1٪) د کوډ کولو په سیمه کې موقعیت لري، او اغیزمن شوي جینونه د بوویلیسټیک کې ښودل شوي فعال کټګوریو سره سم مشخص شوي (شکل 6A، B). په هر فعال کټګورۍ کې د جینونو ټول شمیر په پام کې نیولو سره، د "لیپیډ میټابولیزم" کټګورۍ کې جینونو ډیر SNPs وښودل، وروسته د "حجروي دیوال او حجروي پروسې" او "منځني میټابولیزم او تنفس" لخوا، دا په ګوته کوي چې دوی د M. bovis ارتقا کې دي.
د پرتګال څخه د ایم بویس ډیټاسیټ د مراتبو تحلیل (n = 42). د هرې فعالې کټګورۍ (A) لپاره د ثبت شویو SNPs او اغیزمنو جینونو ټولټال شمیر. د فعالیت کټګورۍ (B) لخوا ثبت شوي مترادف او غیر مترادف بدلونونو ټولټال شمیر.
په نړیواله کچه، د dN/dS اوسط تناسب د 1.5 څخه غوره دی، کوم چې دا په ګوته کوي چې نړیوال ارتقايي فشار د پلرني حالت څخه د خلاصون لپاره دی او د مثبت (متنوع یا لارښود) او/یا آرامۍ پاکولو انتخاب سناریو استازیتوب کوي. د "ویرولینسي، ډیټوکسیفیکیشن، تطابق"، "داخلولو ترتیبونه او فیجونه"، او "تنظیمي پروټینونو" په کټګوریو کې، د SNPs دوه پر دریمه برخه څخه ډیر غیر مترادف دي (شکل 6B).
په ټولو کټګوریو کې، داسې جینونه شتون لري چې ډیری SNPs لري، چې په پایله کې یې د اوسط بدلون کچه (یعنې په هر جین کې اوسط SNP) له 1 څخه زیاته ده (شکل 6A). Pks12 (Mb2074c) د 15 SNPs سره او fas (Mb2553c) د 8 SNPs سره لوړ بدلون ارزښتونه لري. دا دواړه جینونه د غوړ اسید میتابولیزم کې ښکیل دي. pks جین د پولیکیټایډ ترکیب (PKS) کوډ کوي، کوم چې یو څو اړخیز انزایم دی چې د مایکوباکټیریا حجروي دیوال لیپید بایوسینتیسس کې ښکیل دی74,75. دا جین یو څو اړخیز پولیپټایډ کوډ کوي چې د مایکوکیټایډز 74,76 ترکیب کې ښکیل دی. د فاس جین د مایکولیک اسید په ترکیب کې ښکیل دی. دا دواړه جینونه د کوربه سره په تماس کې د حجروي دیوال بایوسینتیسس کې مهم رول لوبوي.
د مایکوباکټیریم بوویس د ارتقا د لا مطالعې لپاره، د ځانګړو جینونو دوه سیټونه تحلیل شول. د ترتیب جوړښت او فایلوجینټیک میتودونو په کارولو سره مخکې خپاره شوي اثار هغه جینونه پیژندلي چې د MTBC پلرونو لخوا د HGT له لارې د تنوع څخه دمخه ترلاسه شوي وو 37,38. دا جینونه په ضمیمه جدول 2 کې لیست شوي دي. د ټول 77 جینونو SNP ویش چې ممکن د HGT سره تړاو ولري تحلیل شوی، او 26 پولیمورفیک سایټونه پیژندل شوي، کوم چې په ډیری قضیو کې (78٪) د غیر مترادف (NS) بدلونونو پایله درلوده (ضمیمه جدول 2). د MTBC جینوم په اړه پخوانیو کارونو ښودلې چې د HGT سیمه د جینوم د پاتې برخې په پرتله د NS SNP لوړ تناسب ښیې. که څوک فکر کوي چې دا بیا یوځای کیدونکي سیمې د MTBC پلرونو لخوا ترلاسه شوي، او له همدې امله، دوی د لرغونو پولیمورفیزمونو څخه ډیر استازیتوب کوي، نو د مترادف بدلونونو تناسب تمه کیږي لوړ وي، ځکه چې د NS بدیلونه تمه کیږي چې د امینو اسید بدلونونو له امله د منفي انتخاب له لارې له منځه یوړل شي ممکن د پروټین فعالیت بدل کړي. له همدې امله، زموږ پایلې ښیي چې فعالې پایلې ممکن د HGT په څیر جینونو د ځای په ځای کیدو څخه رامینځته شي، کوم چې د ارزښتناکه تطابق جینیاتي تنوع لپاره د دوی اهمیت منعکس کوي.
د دې تحلیل سره په موازي ډول، د 3R (DNA ترمیم، نقل، او بیا ترکیب) سیسټم اجزاو کوډ کولو جینونه په بشپړه توګه د هغه لیست سره سم معاینه شوي چې مخکې د dos Vultos او همکارانو (2008) لخوا خپور شوی و. د ورته DNA ټوټو تبادله په مستقیم ډول نشي لیدل کیدی، که څه هم دا ممکن یو مکرر پروسه وي کله چې نږدې اړونده باکتریا پکې ښکیل وي، لکه د دې ډیټا سیټ په قضیه کې؛ سربیره پردې، دا پروسه ممکن د DNA ترمیم میتودونو 72 کلیدي وي، نو په همجنسي بیا ترکیب کې رول ولوبوي. د 54 جینونو لخوا ویشل شوي ټول 26 پولیمورفیک موقعیتونه پیژندل شوي (ضمیمه جدول 3). د جینونو په دې سیټ کې، د NS بدلونونه د پایلو شاوخوا 65٪ برخه جوړوي، کوم چې د مایکوباکټیریم نري رنځ په اړه د پخوانیو راپورونو سره مطابقت لري.