Табигатькә барганыгыз өчен рәхмәт. Сез кулланган браузер версиясе CSS өчен чикләнгән ярдәмгә ия. Иң яхшы тәҗрибә өчен, без браузерның яңа версиясен кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'ның яраклашу режимын сүндерегез). Шул ук вакытта, дәвамлы ярдәмне тәэмин итү өчен, без стильләр һәм JavaScriptсыз сайтларны күрсәтәчәкбез.
Геном эзлеклелеге йогышлы авыруларны тикшерү өлкәсен җанландырды, авыру эпидемиологиясен, патогенезны, хуҗа-патоген үзара бәйләнешен һәм патогеннарга куелган эволюцион процессны ачыклады. Микобактерия туберкулез комплексы (MTBC) Микобактерия бовисын җирдәге имезүчеләрдә туберкулез (туберкулез) китереп чыгаручы хайван адаптацион әгъзаларының берсе дип саный, һәм бактерия эволюциясенең типик моделе. Башка MTBC әгъзалары кебек, Микобактерий бовисы каты клонланган, әкренләп үсә торган патоген дип санала, һәм рекомбинация яки горизонталь ген тапшыру билгесе юк. Бу эштә без чагыштырма геномиканы бөтен геном эзлеклелегенә (WGS) кулланабыз, төрле токымнардан (Европа һәм Африка) 70 мөгезле эре терлектән торган М. терлекләренең генетик төрлелеге турында төшенү өчен М. Үзгәртеп кору билгеләрен бәяләү өчен өч төрле ысул кулланыла. Бөтен дөнья буенча рекомбинация вакыйгаларының аз саны ачыкланды һәм нык таяныч белән ике бәйсез ысул белән расланды. Шуңа да карамастан, мутацияләр белән чагыштырганда, рекомбинация М. бовисның төрлелегенә көчсезрәк тәэсир итә (гомуми r / m = 0.037). Безнең мәгълүматлар җыелмасында Микобактерия бовисының клональ комплексында алынган r / m аермасы гомуми төшенчәгә туры килә, рекомбинация дәрәҗәсе бер үк таксономик төрләргә билгеләнгән нәселләр арасында төрлечә булырга мөмкин. Бу эшкә нигезләнеп, Микобактерия бовисындагы рекомбинацияне искәртеп булмый, шуңа күрә ул чагыштырма геномика тикшеренүләрендә алга таба да көч куярга тиеш, анда WGS зур мәгълүматлар дөньяның төрле эпидемиологик сценарийларыннан тора. Аннан соң кечерәк Микобактерия бовис мәгълүматлар җыелмасында (n = 42) өстәмә анализ ясалды, һәм күп санлы туберкулез таралуыннан 1800 дән артык локи ачыкланды, аларның ким дигәндә бер штаммы бер нуклеотид полиморфизмын күрсәтте (SNP). Күпчелек (87,1%) кодлаштыру өлкәсендә урнашкан, һәм синоним булмаган үзгәрешләрнең (dN / dS) глобаль катнашлыгы 1,5-дән артып китә, бу уңай сайлау М. бовиска куелган мөһим эволюцион көч булуын күрсәтә. SNP-ларның зур өлеше "липид метаболизмы", "күзәнәк стенасы һәм кәрәзле процесслар", һәм "арада метаболизм һәм сулыш" функциональ категорияләренә бай геннарда табылды, аларның биологиясендә һәм Микобактерия бовисы эволюциясендә потенциалын ачтылар. MTBC ата-бабаларындагы горизонталь ген тапшыруга мохтаҗ булган һәм 3R (ДНК ремонтлау, репликацияләү һәм рекомбинацияләү) системасына кертелгән геннарны җентекләп карау Тайжиманың D нейтраль тестының глобаль уртача тискәре кыйммәтен күрсәтә, бу үткән сайлап сканерлауны күрсәтә.
Микобактерия туберкулез комплексы (MTBC) - бактерия патогеннарының иң уңышлы таксаларының берсе һәм бактерия эволюциясенең гадәти очрагы. Аның әгъзалары геномик дәрәҗәдә гаҗәп югары нуклеотид үзенчәлеген күрсәтәләр (> 99%) 1,2. Төрле MTBC экотиплары туберкулезга китерергә мөмкин, ул йогышлы грануломатоз авыруы, микро-имезүчеләрдән алып кешеләргә кадәр 4,4,5. Хәзерге вакытта комплекс кешеләргә керә [М. Туберкулез (Mtb), Микобактерия африканумы) һәм хайваннарга яраклаштырылган патогеннар (Микобактерия бовисы, Микобактерия капитумы, Микобактерия пиннипедумы, Микобактерия микробобактеры, Микобактерия монгее, Микобактериум Микобанерий, Микобактериум, Микобактериум, "dassie") 5,6. М.
MTBC системалы рәвештә каты клональ комплекс буларак тасвирлана, һәм аның халык структурасы ачыкланган төрлелек, кимчелекләр, сайлап сканерлау һәм генетик дрифт 9,10 белән идарә ителә. Катлаулы каты клональ эволюцияне күздә тотсак, югалган полиморфизмнар рекомбинация белән торгызылмый. Бу шартка нигезләнеп, дифференциаль регионның (RD) һәм TbD1 (Mtb конкрет бетерү 1 регион) геномик бетерү эзлекле вакыйгалары MTBC эволюциясенең молекуляр билгеләре буларак тәкъдим ителде2,5,11. Чагыштырма геномика һәм бөтен геном эзлеклелеге (WGS) эше кеше адаптацияләнгән әгъзаларын тугыз нәселгә бүләргә ярдәм итә (Микобактерия туберкулезы L1, L7, L8; һәм Микобактерия африканум L5, L6, L9), L2 - L4 уртак TbD1 өлкәсе 13,12. Моннан тыш, хайваннарга җайлаштырылган әгъзаларга уртак ата-бабалары белән уртаклашырга тәкъдим ителә, алар RD7, RD8, RD9 һәм RD102, 5, һәм 14-нче классларда бетерү белән билгеләнәләр.
Горизонталь ген тапшыру (HGT) һәм рекомбинация вакыйгалары сирәк санала һәм MTBC ата-бабаларында барлыкка килә, бөтен MTBC әгъзасының төрле тарихы түгел, 15,16,17. Хьюз һәм хезмәттәшләр (2002) һәм Гутакер һәм хезмәттәшләр (2006) тарафыннан ясалган ике башлангыч доклад рекомбинация вакыйгалары М. MTBC-та рекомбинациянең ачык булмавының сәбәпләре: (1) механик процесс һәм HGT сәләтен югалту; 2) HGT вакыйгаларының сирәклеге; (3) MTBC урынында 14,17 рекомбинация вакыйгалары мөмкинлеге юк. Күптән түгел, MTBC 20 һәм Mycobacterium bovis 21 өчен кулланылган кайбер тулы геномлы эзләнүләр рекомбинациягә дәлилләр китерделәр, беренче булып MTBC штаммнары кечкенә ДНК фрагментларын алыштыралар, ләкин чикләнгән нуклеотид эзлеклелеге аркасында, бу вакыйгалар әле дә сизелми.
Микобактерия бовисы - терлекләрдән (күбесенчә терлекләр) MTBC әгъзасы, ул шулай ук ирекле һәм койма кыргый хайваннардан аерылырга мөмкин4,22,23,24. М. бовис биш төп клональ комплекска әверелде [Европа 1 (Eu1), Европа 2 (Eu2), Европа 3 (Eu3), Африка 1 (Af1) һәм Африка 2 (Af2)], сполиготип профиле буенча, махсус бетерү һәм бер нуклеотид полиморфизмнары (SNP) 25, 26, 27, 28, 29. Бу клональ комплекслар Микобактерия бовис популярлыгының төрле структурасын һәм аның географик регионнар белән бәйләнешен күрсәтәләр. Моннан тыш, Зимпел һәм хезмәттәшләре (2020) үткәргән күптән түгел WGS эше Микобактерия бовисының SNP нигезендә филогения эшләде, 1900 дән артык геном белән, ким дигәндә дүрт төрле нәсел барлыгын күрсәтә (Lb1 дән Lb1 дән Lb4), алар алдан билгеләнгән клон комплексы белән тулысынча туры килмиләр, шулай ук географик үзенчәлек. Бу авторлар филогения һәм молекуляр танышуга дифференциаль анализ ясадылар, ләкин рекомбинацияне өйрәнмәделәр30.
Төрле молекуляр техниканы кулланып алдагы эш, мәсәлән, сполиготиплау, MIRU-VNTR (микобактериаль интерперсланган кабатлау берәмлеге үзгәрүчән тандем кабатлау саны), һәм күптән түгел SNP язу М.Бовис штаммнары арасында билгеле бер генетик төрлелекне күрсәтте, 31,32,33, 34,35. Генетик үзгәрүне дифференциацияләү авыру эпидемиологиясен өйрәнүдә мөһим коралга әйләнде, бу патогенезны, вируслылыкны һәм авыруларны таратуны тирәнтен аңларга ярдәм итә. WGS ысулының барлыкка килүе Микобактерий бовис геномы белән төрле хуҗаларга һәм эпидемиологик сценарийларга адаптация һәм ныклык процессында эволюцион йөртү факторларын ачу мөмкинлеген бирә.
Бу эштә без Микоплазма бовисының эволюцион процессын, аеруча филогенетик бәйләнешләрне һәм рекомбинация вакыйгаларын чишү өчен, төрле Микоплазма бовис мәгълүматлар базасында (n = 70) чагыштырма геном анализы кулланабыз. Бу анализга өстәмә буларак, М. (ДНК ремонтлау, репликацияләү һәм рекомбинацияләү) система ген компонентлары 39. HGT аша алынган геннарны сайлагыз, чөнки алар борыңгы полиморфизмнарны күрсәтә алалар, шуңа күрә аларда синоним үзгәрешләрнең зур өлеше булырга мөмкин. 3R системасына кертелгән геннар сайланды, чөнки М. туберкулез штаммнары буенча алдагы эш бу геннар өстендә эшләүче гомуми тискәре / чистарту сайлауларын күрсәтте, һәм алар эволюциядә мөһим роль уйный алалар 39. Бу эшнең тагын бер максаты - үзгәртеп кору вакыйгаларының булуын ачыклау. Шуңа күрә, Португалиядән алынган мәгълүматлар базасында Европа клон комплексының геномнары һәм клон комплексын билгеләмәгән штаммнар гына барлыгын исәпкә алып, без барлык клон комплексларының вәкилен алу өчен, һәм нәтиҗәләрнең ныклыгын һәм киңлеген яхшырту өчен, ачык булган геном мәгълүматларын кертергә булдык.
Бу эшнең үзәге - Португалия эндемик күп хуҗалы туберкулез күренешеннән 42 яңа чираттагы Микоплазма бовисы геномнары (астагы детальләр), бу эшнең үзәге. Португалиядән алынган мәгълүматларның Европа 2 клон комплекслары һәм билгеләнгән комплекслары булмаган штаммнары гына барлыгын исәпкә алсак, М. бовис клон комплексларының барлык вәкилләрен үз эченә алган мәгълүматлар җыелмасын киңәйтү өчен, бөтен геномлы эзлекле мәгълүматлар өстәлде. Шуңа күрә, бу эштә өч геномлы эзлекле мәгълүмат чыганагы кулланылды: тулы / проектлы геном җыю, NCBIда сакланган 10 га кадәр скафолд (Милли Биотехнология Мәгълүмати Centerзәге) (n = 15 изоляция); SRAда сакланган (уку архивының Illumina fastq файлы) М. бовис клоннарының катлаулы төрлелеген күрсәтә (n = 12 изоляция) 30; һәм Португалиядән 42 яңа эзлекле геном. Микобактерия бовисы BCG (Bacille Calmette-Guerin) NCBI эзләүдән чыгарылды. M. bovis AF2122 / 97, гадәттә, мәгълүматлар базасына керер өчен белешмә геном буларак кулланыла. Африка 1 клонлау комплексы белән күрсәтелгән бөтен геном эзлеклелеге, һәм Af2 һәм Eu1 вәкиллекле штаммнарыннан аз санлы геномнар аркасында, бу очракларда SRA тарафыннан бирелгән оригиналь эзләү мәгълүматлары кулланылды. Зимпель һәм аның хезмәттәшләре (2020) эше югарыда телгә алынган клонлау комплексындагы геномны ачыкларга булышты һәм мәгълүматлар җыелмасына кертү өчен Микобактерия бовисын сайларга булышты. Eu3 өчен геномның бер төре генә сурәтләнә (Брангер һ.б., 2020), шуңа күрә без керткән геном Eu3 комплексының аерым вәкиле.
Бөтен дөнья буенча, бу мәгълүматлар җыелмасында 70 терлек М. Бу тикшеренүдә кулланылган Микобактерия бовисының тулы мәгълүматы (кушылу номерын да кертеп) 1 нче таблицада һәм өстәмә таблицада күрсәтелгән.
Микобактерия бовисының 42 яңа геномы, Португалиянең хайван туберкулезы нокталарыннан һәм 12 елдан артык таратылган бу тикшеренү үзәге, чөнки потенциаль кыргый хайваннар-терлекчелек системалары 31,36 даими контрольдә тотыла (өстәмә рәсем 1). Киләсе процедуралар буенча, бу штаммнар 2003 - 2015 елларда терлекләрдән (n = 14), кызыл боланнардан (n = 16) һәм кыргый дуңгызлардан (n = 12) изоляцияләнделәр: тәкъдим ителгән протокол күрсәтмәләре нигезендә хайваннарны җыеп эшкәртегез. Мәдәният 37 ° C температурада инкубацияләнә һәм үсеш атнага бер тапкыр ким дигәндә 12 атна тикшерелә. Колонияләр турыдан-туры глицерол эремәсендә -80ºC температурада саклана. Микобактерия сайлап алу чарасында (Middlebrook 7H9, BD диагностика), оригиналь архивланган үрнәкләр WGS программасының ДНКсын алу өчен витродагы бер витро аша уздылар. Моның өчен туңдырылган культура запасы эремәсе 5% натрий пируват һәм 10% АДС (50 г альбумин, 20 г глюкоза, 1 л суда 8,5 г натрий хлорид) белән 37 ° C Ретрейнда баетылды. 4 атна үсештән соң, уртача яңартылды һәм үсеш күзәтелгәнче культура даими контрольдә тотылды. Күзәнәкләр центрифугация белән җыеп алындылар, пелет 500 µЛ фосфат буферланган тозлы (ПБС) реанимацияләнде, 99 ° C 30 минутта җылытылды, центрифугацияләнде, һәм супернатант WGS кадәр -20 ° C сакланган. Барлык процедуралар 3 дәрәҗәдәге биосистема объектларында алып барыла.
WGS парлы-геном китапханәсе һәр ДНК үрнәгенең уникаль индексы ярдәмендә әзерләнгән, һәм Illumina MiSeq (2 × 250 pb) (40 үрнәк) һәм HiSeq (2 × 150 pb) (ике изоляция) технологиясе (Еврофинс Геномика, Германия) кулланыла. Manufactитештерүче күрсәтмәләре буенча, Геном ДНК эзлеклелеге өчен Иллумина Геном Анализаторын икеле очлы модуль кушымтасы белән кулланыгыз, һәм китапханә төзү өчен Иллуминадан Nextera XT DNA Китапханәсе әзерләү комплектын кулланыгыз.
SRA (n = 12) мәгълүматларын исәпкә алып, клон комплексын идентификацияләү 30, 41, 43 басмаларның метадайыннары итеп кулланылырга мөмкин. Тулы геномны исәпкә алганда, AF2122 / 97 һәм Микобактерия бовисы 3601, Eu1 һәм Eu3 клон комплексының тулы әгъзалары, минем Euc1 һәм Eu3 клон комплексының тулы өлеше, 29. туберкулез H37Rv (NCBI кушылу саны NC_000962.3). Геномны тигезләү MAFFT (аминокислотаның яки нуклеотид эзлеклелегенең күп тигезләү программасы, 7.458 версиясе) һәм -addfragments48 параметры ярдәмендә башкарыла. Аннары, төрле клональ комплексларның юклыгын һәм / яки SNP үзенчәлекләренең булуын эзләгез.
Яңа чираттагы Микобактерия бовисы (n = 42) һәм җыелган геном проектының оригиналь укулары (n = 3) комплексны vSNP торбасы аша H37Rv микобактерия туберкулезы геномы белән тигезлиләр һәм төрле клоннарның бетерү һәм / яки SNP үзенчәлекләре бар.
Геномик мәгълүматны тиешле клональ комплекска билгеләү өчен, функцияләр булмаудан һәм / яки SNP һәм сполиготип профильләренең булмавыннан мәгълүмат туплагыз. Дүрт җыелыш өчен сполиготип ясау профиле турында әйтеп булмый, шуңа күрә алар "катлаулылык юк" төркеменә керәләр.
Бу эштән соң биоинформатика эш процессы де-ново җыюдан һәм рекомбинация вакыйгаларын һәм геном полиморфизмнарын тикшерү максатыннан белешмә стратегиясенә күчерелә. Рәсем 1 алдагы адымнарның схемасын күрсәтә. Рекомбинация анализы өчен барлык геномнар конференцияләрнең һәм бәйләнешле күрсәткечләрнең ныклыгын арттыру өчен кулланыла.
Геном консенсус эзлеклелегендәге хаталарны киметү өчен, без башта ново җыюны алдык, аннары төп тигезләүләрне алдык. "Unicycler" торбасы хәзерге вакытта https://github.com/rrwick/Unicycler49 сайтында бар һәм 54 эзлекле геномның яңа җыелышын башкару өчен кулланыла (42 яңа эзлекле һәм 12 тиз файл SRAдан алынган). Кыскасы, нульдән җыелганчы, FastQC 0.11.7 версиясендә (https://github.com/s-andrews/FastQC), һәм Trimmomatic 0.36 версиясендә ("Адаптерларны кисү һәм укудан башка яктырту эзлеклелеге" һәм "Уку ахырыннан нигезләрне кисү" кулланыла). (http://www.usadellab. Дөрес булмаган җыюдан саклану өчен консерватив күпер режимы сайланды, һәм k-mer зурлыгы эзләнде һәм уку озынлыгының 20% белән 95% арасында сайланды. SPAdes күрсәтмәләрен үтәгез һәм уку күләмен исәпкә алыгыз, 300 ат көченнән кечерәк контигларны бетерегез, һәм 20 укылган тирәнлекне каплауны кисегез. Де-ново җыю стратегиясендә югары кабатланган проле-глютамат (PE) һәм проол-пролин глутамат (PPE) паралоглары кебек геном өлкәләре алынмады.
Де-ново җыю сыйфаты QUAST торбасы аша бәяләнә (http://quast.sourceforge.net/quast.html), бу контигны яңартуны җиңеләйтә һәм M. bovis AF2122 / 97 сылтама геномы (NCBI кушылу номеры LT708304.1) Карта ясау (сыйфат параметрлары өчен өстәмә таблицаны карагыз).
VSNP торбасы ярдәмендә (https://github.com/USDA-VS/vSNP), Illumina эзлеклелегеннән М. Геном анализлау коралының иң яхшы практик тәкъдимнәре буенча (GATK) 53, 54, 55 стандарт фильтр параметрларын яки вариант масса балларын рекалибрия өчен кулланыгыз. Нәтиҗә иң түбән SAMtools массасы 150 һәм AC = 2 ярдәмендә чистартыла. Шулай ук Кракенны (http://ccb.jhu.edu/software/kraken/) кулланыгыз, пычрануны кире кагу өчен. Безнең эштә эзлекле стратегияләрне картага китерү өчен кулланылган vSNP торбасы билгеләнгән SNP һәм максатларны тикшерә, шулай ук катнаш инфекция сценарийларын да кертә. Укылган геномны каплау 99% тан яхшырак (өстәмә таблица 1).
Хаталарны һәм ялгыш SNPларны картадан саклап калу өчен, түбәндәге очракларда вариантны фильтрлагыз: (1) 20 укымыштан азрак, 2) 0.9-тан ким булмаган ешлык белән табыла, 3) ул ким дигәндә бер Штаммда, ләкин ким дигәндә бүтән штаммда кимчелекләр бар. Интеграль геномика тамашачысы (IGV) 2.4.19 версиясе (http://software.broadinstitute.org/software/igv/)56 SNPларны һәм позицияләрне визуаль рәвештә тикшерү өчен кулланылды, карталар яки тигезләү проблемалары. Пролин-глютамат (PE) һәм проол-пролин глютамат (PPE) геннары бик күп кабатланган һәм күп геннар гаиләсенең өлеше булганлыктан, алар Иллумина эзлеклелеге һәм аңлашылмаучанлыгы белән җиңел аңлашылмыйлар, шуңа күрә алар микобактериаль биоинформатика эш процессы туберкулез комплексы әгъзаларын SN картасын раслау өчен кулланалар. Шуңа күрә без анализдан PE / PPE геннарын һәм индексларын фильтрладык.
Бовилист сүзләре буенча (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/), барлык SNPлар функциональ категорияләргә бүленә. SnpEff торбасы (https://pcingola.github.io/SnpEff/) SNP нәтиҗәләрен (синоним яки синоним булмаган үзгәрешләр) куллану өчен кулланыла. Mycobacterium bovis AF2122 / 97 геномының яңа мәгълүмат базасы булдырылды (LT708304.1).
Төп геномның күп тигезләнеше Parsnp v1.2 ярдәмендә башкарылды, хәзерге вакытта https://github.com/marbl/parsnp57 сайтында бар, 69 тулы геном / корал җыю (-c варианты белән) һәм М. bovis AF2122 / 97 (LT708304.1) сылтама буларак кулланыла. Дүрт төп күп тигезләү эшләнде: Eu2 клонлау комплексы әгъзалары (n = 37), шул исәптән Европа клонлау комплексының барлык әгъзаларын (n = 44), шул исәптән Европа һәм Африка клонлау комплексының тоташу ноктасын (n = 51), һәм бу тикшеренүдә барлык Микобактерия бовисын кертәләр (n = 70).
Parsnp тарафыннан ясалган төп тигезләү максималь ихтималны (ML) CIPRES Science Gateway v3.3 (http://www.phylo.org/)58 кулланып, RAxML ярдәмендә кулланыла, һәм 1000 реплика ясый.
Рекомбинация вакыйгаларының параллель булуын тикшерү өчен өч төрле алгоритм һәм биоинформатика кораллары кулланыла: SplitsTree4 программа тәэминаты, Губбинс (нуклеотид эзлеклелегендә рекомбинация аша нәсел) торба, һәм RDP4 (рекомбинацияне ачыклау программасы, бета 4.101 версиясе) программа тәэминаты.
SplitsTree4 v4.15.1 (http://www.splitstree.org/)59) кулланылган бүленешне бүлү ысулы тамырсыз филогенетик челтәрне исәпләү өчен кулланыла, статистик тикшерү өчен Phi тестын кулланып, әһәмият чикләре p = 0.05. Parsnp-ның төп күп тигезләү анализы кертү рәвешендә кулланыла, һәм челтәр стандарты буларак бүленү бүленеше тормышка ашырыла.
Губбинс торбасы v2.3.1 (https://github.com/sanger-pathogens/gubbins60 микобактерия бовисына рекомбинациянең тәэсирен бәяләүнең башка ысулы буларак демократик параметрлар белән эшли. Бору торбасында кертелгән алгоритм тиешле клон нәселен реконструкцияли, безнең мәгълүматлар җыелмасы тулы бер геном / LT2). Рекомбинация вакыйгасын күрсәтүче SNP кластерын ачыклау өчен агачның һәр тармагында SNP позициясен сканерлагыз. Рекомбинация вакыйгасы юк дип уйлагыз, димәк, филиалда булган SNPлар тигез бүленергә тиеш, һәм RAxML-ның иң яхшы тупланган ML агачы кулланыла.
Ниһаять, Губбинс торбасы тәкъдим иткән үзгәртеп кору вакыйгасын раслау өчен, RDP467 (RDP61, GENECONV62, Bootscan63, Maxchi64, Chimaera65 һәм SiScan66) кулланылган алты алгоритм Парснпның төп күп тигезләнешенә кулланыла. Без RDP4 га кертелгән алгоритмнарның ким дигәндә өчесе эзлекле рәвештә һәр рекомбинация вакыйгасын тикшерү өчен мөһим сигнал күрсәтергә тиешлеген билгеләдек.
Губбиннар һәм РДП программалары рекомбинация сигналларын 500 ат көченә кадәр тәрәзәдәге төп тигезләүләрне тикшереп, PE / PPE геннарының де-ново җыю вакытында кертелгән рекомбинация сигналларына комачауламавын раслап, рекомбинация вакыйгасын ачыклаучы ген тирәсен тикшерегез. Тулы геномны кулланып синлинар карта MAUVE-күп геномлы тигезләү (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) ярдәмендә төзелгән, җирле геном тәрҗемәләрен яки инверсияләрен чыгару өчен. Моннан тыш, бөтен геном SyntTax веб-серверы аша (https://archaea.i2bc.paris-saclay.fr/SyntTax/) аминокислота эзлеклелегендә гомолинар анализ ясау өчен кулланылды.
Португалиянең күп хуҗалы туберкулез системасыннан алынган геном мәгълүматларын тирәнрәк анализлау - әдәбиятта искә алынган геннарның полиморфизмын тикшерү. Бу геннар 37,38 һәм MTBC ата-бабалары тарафыннан HGT (ДНК ремонтлау, репликацияләү һәм рекомбинацияләү) системасы компонентлары ярдәмендә алынган 3R ген кодлау. ClustalX v2.1 кулланыгыз (http://www.clustal.org/clustal2/) һәм DnaSP v6.12.03 кулланыгыз (http://www.ub.edu) Таҗиманың D нейтраль тест параметрын кертү.
69 микоплазма бовисы изоляциясе һәм белешмә геномнар нигезендә максималь филогенетик агач алынган (2A рәсем). Бер генлы агачлар яки күп җирле агачлар белән чагыштырганда, бу стратегия көчлерәк агачлар барлыкка китерергә мөмкинлек бирә, алар бөтен геномның үзгәрүчәнлеген кулга алмыйлар, шуңа күрә 68,69 төрне аеру өчен түбән сәләтне күрсәтәләр. ML агачының топологик төзелеше гадәттә клоннарның катлаулы классификациясенә туры килә. Eu2 геномы филиалда тупланган, һәм Af1 геномы бергә тупланган (2A рәсем). Нәтиҗә шулай ук Микобактерия бовисының билгеле эволюцион бәйләнешенә туры килә, ягъни Eu1 әгъзасы белән бүтән клональ комплекслардан һәм геномнардан торган төркем арасында зур аерма бар, ләкин 30 клон комплексы күрсәтелмәгән. Клон комплексы белән филогенетик агачта күзәтелгән бәйләнеш арасындагы кечкенә туры килмәү, клон комплексының билгеле бер геном регионнары нигезендә сурәтләнүе белән аңлатыла, ә филогенетик агач бөтен геномны күрсәтүче төп геномнарның тигезләнешенә нигезләнгән.
Филогенетик агачның иң зур ихтималы (ГТР) Микобактерия бовис геномының төп геном тигезләнеше нигезендә төзелгән (A) һәм (B) рекомбинация мәйданын бетергәнче. Филиал төсләре Микобактерия бовис клон комплексын күрсәтә: Европа 1 кызгылт, Европа 2 кызыл, Европа 3 зәңгәр, Африка 1 кызгылт сары, Африка 2 яшел. Агач тамырланган һәм масштабка тартылган, һәм ботак озынлыгы һәр сайтны алыштыру рәвешендә үлчәнә.
Микобактерия туберкулез комплексы клональ эволюция дип сурәтләнә, һәм еллар дәвамында тупланган дәлилләрнең күбесе HGT һәм рекомбинация вакыйгалары MTBC15,17,18 дәрәҗәсендә ачыкланмый дигән фикерне раслый.
Элеккеге эш күрсәткәнчә, MTBC штаммнары арасында чикләнгән рекомбинация 20,21 булырга мөмкин, калганнары үлчәнә торган рекомбинация вакыйгаларын ачыклый алмады 70,71. Микобактерия туберкулезын 70,71 дип саный торган алдагы эштән аерылып торган Микобактерия бовисына игътибар итеп бу мәсьәләне кабат тикшерегез. яисә MTBC-ны тулаем алганда карагыз, М. яисә терлекләрнең чикләү фракцияләрен генә карагыз. Микобактерия мәгълүматлар базасы, бу эштә, рекомбинация өчен экранда кулланылган барлык клональ комплексларны күрсәтүче барлыгы 70 штамм бар. Мәгълүматлар җыелмасы дүрт кумулятив дәрәҗә буенча масштабланган: (1) Eu2 әгъзалары, (2) барлык Европа клон комплекс әгъзалары (ягъни Европа), (3) Европа һәм Африка клон комплексы (Eu + Af) һәм (4) бөтен мәгълүмат коллекцияләре (инде тасвирланган клон комплексларына кермәгән геномнарны да кертеп).
Бу гипотезаны алга таба өйрәнү өчен, геномнар арасында рекомбинация вакыйгаларының булмавын бәяләү өчен бүленгән челтәр эшләнде, чөнки бу ысул шәхесләр арасындагы ата-бабалар арасындагы мөнәсәбәтне күз алдына китерә һәм каршылыклы филогенетик сигналлар күрсәтә ала. Анализдагы дүрт мәгълүмат җыелмасы челтәрдә циклларның булуын раслады (ягъни бер агачка әйләнмәгән өлкәләр), ләкин Phi тестының статистик ярдәме юк (Eu2, p = 0.0956; Европа, p = 0.1637; Eu + Af p = 0.2774; бөтен мәгълүматлар җыелмасы p = 0.2451), бу үзгәртеп кору вакыйгалары өчен начар дәлилләр китерә.
Европада 2 геном (n = 37) (A), Европа геномнары (n = 44) (B), Европа һәм Африка геномнары (n = 51) (C) һәм бөтен мәгълүматлар җыелмасы (n = 70) (D).
Бу анализдан соң, һәм барлык челтәрләрдәге цикллы күзәтүләрне исәпкә алып, Губбинс торбасында кертелгән реконструкция алгоритмы клон нәселен реконструкцияләү һәм рекомбинациянең М. бовис геномына тәэсирен бәяләү өчен кулланылды. Рекомбинация вакыйгаларының кумулятив санын карагыз, аларның күбесе терминал ботакларында (ягъни бер геномда) булган (таблица 2). Бу күрсәткечләр бөтен мәгълүматлар җыелмасының эзлеклелеген күрсәтәләр һәм рекомбинация вакыйгаларының ешлыгы мутацияләргә караганда 200-300 тапкыр күбрәк булуын күрсәтәләр. Рекомбинациянең чагыштырма ставкаларын һәм филиалдагы нокта мутацияләрен күрсәтүче rho / theta параметры 0,0037 белән 0,0056 арасында булып күренә (таблица 3). Күптән түгел, М.
Алга таба, r / m параметры рекомбинациянең һәм мутация кертүнең күптөрлелеген күрсәтә, һәм аның уртача бәясе 0.025 белән 0.037 арасында, бу мутацияләр белән чагыштырганда, рекомбинациянең М.Бовисның генетик төрлелегенә түбән гомуми йогынты ясавын күрсәтә (таблица 3). Киң чагыштыру өчен, шундый ук ысул 23 геномнан торган MTBC мәгълүматлар базасы өчен r / m параметрын бәяләү өчен кулланылды, уртача бәясе 0,48620, ә Патане һәм хезмәттәшләренең 38 М. бовис мәгълүматлар базасы өчен ул уртача кыйммәтнең 0,98 булуын исбатлады. Беренче тикшеренүдә, М. бовис (М. бовис BCG һәм белешмә штамм) эшенә кертелгән 23 геномның икесе генә, шуңа күрә алынган кыйммәт М. туберкулез геномының чиктән тыш кысылуы аркасында икеләтә булырга мөмкин. Икенче докладта, анализланган Микобактерия бовис популяциясе нигездә АКШ һәм терлек хуҗаларыннан алынган. Моннан аермалы буларак, безнең мәгълүматлар җыелмасында күбрәк географик урыннар һәм кабул итүче төрләр күрсәтелә, һәм төрле клональ комплексларга төркемләнгән геномнар да кулланыла, шулай итеп халыкның тирән һәм киңрәк белеменә ирешәләр. Мәгълүматлар җыелмасы белән алынган уртача кыйммәтнең аермасы рекомбинация дәрәҗәсе шул ук таксономик төрләргә билгеләнгән нәселләр арасында бик нык үзгәрә дигән төшенчәгә туры килә, шуңа күрә бу нәтиҗәләр М. бовис клон комплексының рекомбинация аермаларын күрсәтә алуын күрсәтә. Шуңа да карамастан, күп санлы М. бовис геномнарын кертеп, бу мәгълүматны сизелерлек киңәйтү бу пунктны тагын да ачыкларга мөмкинлек бирәчәк. R / m һәм rho / theta параметрлары ботаклар арасында үзгәрүчәнлекне күрсәтәләр, һәм бу нәтиҗә башка бактерия төрләре турындагы докладларга туры килә72,73.
Ниһаять, Губбинс торбасы белән билгеләнгән үзгәртеп кору вакыйгаларын раслау өчен, RDP4 программасында алты төрле алгоритм кулланылды, төрле үзәк чагыштыруларны мөстәкыйль сынау өчен. Бөтен дөнья буенча, Губбинс билгеләгән вакыйгаларның яртысыннан кимрәге RDP4 белән расланды (4 һәм 5 таблицалар). Бөтен мәгълүматлар җыелмасын исәпкә алып, өч рекомбинация вакыйгасы расланды, икесе эчке төеннәр, икенчесе терминал филиалында бер геном катнашуы, алар өчен клональ комплекслар билгеләнә алмаган (4 һәм 5 таблицалар). Терминал филиалларында булган вакыйгаларны ачыклау рекомбинациянең хәзерге М. бовис штаммнарында дәвам итүен күрсәтергә мөмкин, яки нәтиҗәсе урынсыз 70. Бу гипотетик рекомбинация өлкәсендә, позицияләрнең якынча 20% билгеләнмәгән нуклеотидлар (N) бар, шулай итеп рекомбинация сигналына тәэсир итәләр (өстәмә рәсем 2). Моннан тыш, бу төбәк rS генына тәэсир итә, 16S рибосомаль РНКны кодлый, ул бик сакланыр дип көтелә, шуңа күрә бу потив рекомбинация сигналы эзлекле хаталар яки тәртипсезлек нәтиҗәсе булырга мөмкин. Аннары Mb0003 һәм Mycobacterium bovis AF2122 / 97 арасындагы бөтен геном тигезләнеше башкарылды, һәм билгеләнмәгән нуклеотидлар һәм SNPлар барлыгы расланды, шуңа күрә дөрес булмаган тигезләү белән бәйле проблемалар бу эштә тормышка ашырылган биологик мәгълүмат аркасында булмаган, программаны өйрәнгәннән соң.
Эчке төеннәрнең рекомбинация өлкәләрендә бушлыклар яки билгеләнмәгән нуклеотидлар табылмады (4 һәм 5 нче рәсемнәр). Бу вакыйгаларга килгәндә, аларда Eu2 геномы гына бар һәм pks12 генга тәэсир итә, ул мөмкин булган поликетид синтазын кодлый; икенчесе Eu1 геномында теркәлгән һәм мөмкин булган селитраны редуктивлаштыруны кодлаган narX генына тәэсир итә (таблица 4). Гомумән алганда, рекомбинация анализы статистик ярдәм белән рекомбинация фрагментларының чикләнгәнлеген күрсәтә, һәм күрсәтелгән күрсәткечләр рекомбинациянең М. бовис нәселенә түбән йогынты ясавын күрсәтә. Рекомбинация сигналы түбән булыр дип көтелә, ләкин чын эволюция сигналын фон тавышыннан аеру мөһим, бу катлаулы эш. 70, 71 сылтамаларга нигезләнгән җыю һәм туры килмәгән проблемалар белән кертелгән шау-шу сигналын киметү өчен, тулы геномнан кала калганнарның барысы да баштан җыелды, һәм монтажлау сыйфаты QUAST торба анализы белән тикшерелде һәм тәэмин ителде (Өстәмә таблица 1). Моннан тыш, гомуми тикшерүнең ныклыгын һәм төгәллеген тәэмин итү өчен өстәмә анализлар сериясе үткәрелде. Шуңа күрә, narX һәм pks12 геннарның эзлеклелеге сыйфаты Микобактерия бовисы AF2122 / 97 белән уку картасы белән бәяләнде. Рекомбинация өлкәсендә тәкъдим ителгән SNP позициясе метод бүлегендә күрсәтелгән критерийларны кулланып расланды (ким дигәндә 20 уку һәм 0,9 үзгәрү ешлыгы). NarX генының полиморфизмы ике геномда (Mb1792361 һәм Mb7240415; 2,3%) һәм pks12 геномының геномнарында тулысынча расланган: Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb17046, Mb1756, һәм Mb12 геннар. Ләкин, Mb2043 геномы өчен, сигез позициянең алтысы уку тирәнлеге критерийларына туры килми, чөнки SNP максимум 17 уку белән тәэмин ителә, бу 20 билгеләнгән бәядән түбән. Шуңа күрә бу геном мәйданында алты геномның рекомбинациясе расланырга мөмкин (4 һәм 5 нче рәсемнәр).
Микобактерия бовис мәгълүматлар базасының рекомбинация өлкәсенең тигезләнешен җентекләп визуализацияләү, нитрат редуктивын мөмкин булган narX генына тәэсир итә. Эчке төеннәрнең рекомбинация өлкәсендә бернинди кимчелекләр яки билгеләнмәгән нуклеотидлар табылмады. Бу вакыйга Eu1 геномында теркәлгән. NarX генның эзлеклелеге сыйфаты Mycobacterium bovis AF2122 / 97 укуларын планлаштырып бәяләнде. Рекомбинация өлкәсендә тәкъдим ителгән SNP урынын метод бүлегендә күрсәтелгән критерийларны кулланып раслагыз (ким дигәндә 20 уку һәм 0,9 үзгәрү ешлыгы). NarX генының полиморфизмы Mb1792361 һәм Mb7240415 (2,3%) геномнарында тулысынча расланган.
Pks12 генга тәэсир итүче Микоплазма бовис мәгълүматлар базасының рекомбинация өлкәсенең тигезләнешен җентекләп визуальләштерү. Эчке төеннәрнең рекомбинация өлкәсендә бернинди кимчелекләр яки билгеләнмәгән нуклеотидлар табылмады. Pks12 ген кодлау мөмкин булган поликетид синтазына тәэсир иткән вакыйгага килгәндә, анда Eu2 геномы гына бар. Pks12-нең эзлеклелеге сыйфаты Микобактерия бовисының AF2122 / 97 уку картасы белән бәяләнде. Рекомбинация өлкәсендә тәкъдим ителгән SNP урынын метод бүлегендә күрсәтелгән критерийларны кулланып раслагыз (ким дигәндә 20 уку һәм 0,9 үзгәрү ешлыгы). Mb0891, Mb1711, Mb1789, Mb1870, Mb1758, Mb2043, һәм Mb1960 геномнарының полиморфизмнары тулысынча расланды.
PE һәм PPE геннарының кабатланучы регионнары бар, алар Иллуминаның эзлеклелеге һәм дөрес кулланылмавы белән җиңел аңлашылмый, шуңа күрә алар М. туберкулез әгъзаларының биоинформатика эш процессыннан карталардан-эзлеклелек стратегиясен кулланганда гына бетерелә. Бу эштә кулланылган рекомбинация вакыйгалары PE / PPE фильтрламыйча де-ново җыюга нигезләнгән. SplitsTree, Gubbins торбасы һәм RDP4 программа тәэминаты аша өч төрле тулыландыручы ысул һәм алгоритм кулланып, кулланылган стратегияләр хата сигналлары аркасында үзгәртелгән төбәкләрне эшкәртү һәм фильтрлау өчен ныклы дип саныйбыз. Ләкин, PE / PPE генның Gubbins һәм RDP4 программаларына SNP кластерларын ачыклау өчен комачаулавын бетерү өчен, һәм шуңа күрә narX һәм pks12 геннарына тәэсир итәргә тәкъдим ителгән рекомбинация өлкәләрен ачыклау, бу геннарның тирәлеге тикшерелде (Өстәмә рәсем 3-5). М. бовис AF2122 / 97дә, narX ген narK2 һәм Mb1764c белән аерыла, pks12 Mb2075c e Mb2073c белән әйләндереп алынган (Өстәмә рәсем 3-5). MAUVE синлина картасы ярдәмендә барлыкка килгән карта тулы геномның эзлеклелеген саклау һәм үзгәртеп кору турында мәгълүмат бирә, дүрт коллинар блокны күрсәтә, һәм геном тәрҗемә итү яки инверсия билгеләре юк. Моннан тыш, аминокислота эзлеклелеге белән тулыландыру анализы бөтен геномнарда гомологияне исбатлады, һәм narX яки pks12 күрше төбәкләрендә PE / PPE табылмады. NarX өчен бер геном (Mb0030) түбән синонимик баллга ия, чөнки narX ген ике фрагмент (1891 һәм 1890 фрагментлар) итеп билгеләнде. Pks12 өчен, охшашлыклар аркасында, Mb0030 һәм Mb003 түбән синлинарлык балларын күрсәттеләр, ә pks12 протеинның төрле доменнарын күрсәтүче ике һәм өч фрагментта билгеләнде (Өстәмә рәсем 3-5). Бу мәгълүматны исәпкә алып, Gubbins һәм RDP4 программалары икесе дә анализ ясыйлар, тәрәзәдәге максимум 500 ат көченең күп тигезләнешен тикшерәләр, без PE / PPE генның narX һәм pks12 тәэсиренә китергән рекомбинация сигналына комачауламавын расладык.
Бу мәгълүматлар җыелмасында ачыкланган рекомбинация сигналлары калдык булып саналса да, М.Бовисдагы рекомбинацияне кире кагарга ярамый, шуңа күрә ул алга таба анализ предметы булып калырга тиеш, анда төрле эпидемиологик сценарийларның бөтен геномнары мөһим.
Рекомбинация коррекциясенә кадәр һәм аннан соң алынган ML филогенетик агачларын чагыштыру (2A, B) филогенетик бәйләнештә зур үзгәрешләр китермәде, һәм М. бовис штаммнары бер төркемдә кластерлаштылар.
М.Бовисның AF2122 / 97 справка геномы белән укыган 42 яңа М. Күпчелек SNPлар (87,1%) кодлаштыру өлкәсендә урнашкан, һәм зарарланган геннар Бовилистта күрсәтелгән функциональ категорияләр буенча характерлана (6A, B). Eachәрбер функциональ категориядәге геннарның гомуми санын исәпкә алып, "липид метаболизмы" категориясендәге геннар күбрәк SNP күрсәттеләр, аннары "күзәнәк стенасы һәм күзәнәк процесслары" һәм "арада метаболизм һәм сулыш", аларның М. бовис эволюциясендә булуын ачыкладылар.
Португалиядән M. bovis мәгълүматлар базасына иерархик анализ (n = 42). Eachәрбер функциональ категория (А) өчен теркәлгән SNP һәм тәэсир ителгән геннарның гомуми саны. Функция категориясе буенча теркәлгән синоним һәм синоним булмаган үзгәрешләрнең гомуми саны.
Глобаль масштабта, уртача dN / dS нисбәте 1,5-дән яхшырак, бу глобаль эволюцион басымның ата-бабалар халәтеннән котылу һәм уңай (диверсификацияләнгән яки юнәлешле) һәм / яки чистарту сайлау сценарийын күрсәтә. "Вирулентлык, детоксификация, адаптация", "кертү эзлеклелеге һәм этаплары", "көйләүче протеиннар" категорияләрендә SNPларның өчтән ике өлеше синоним түгел (6Б рәсем).
Барлык категорияләрдә дә берничә SNP булган геннар бар, нәтиҗәдә уртача мутация дәрәҗәсе (ягъни бер генга уртача SNP) 1 дән зуррак (6A рәсем). 15 SNP белән Pks12 (Mb2074c) һәм 8 SNP белән фас (Mb2553c) югарырак мутация кыйммәтләренә ия. Бу геннарның икесе дә май кислотасы матдәләр алмашында катнашалар. Pks ген поликетид синтазын (PKS) кодлый, бу микобактериаль күзәнәк стенасы липид биосинтезында катнашучы күп функцияле фермент74,75. Бу ген микокетидлар синтезында катнашучы күп функцияле полипептидны кодлый74,76. Фас ген миколик кислотасы синтезында катнаша. Бу геннарның икесе дә хуҗа белән контактта күзәнәк стенасының биосинтезында мөһим роль уйныйлар.
Микобактерия бовисы эволюциясен алга таба өйрәнү өчен, махсус геннарның ике комплекты анализланды. Элегерәк бастырылган әсәрләр эзлеклелеге һәм филогенетик ысуллар ярдәмендә MTBC ата-бабалары HGT аша диверсификациягә кадәр алынган геннарны ачыкладылар37,38. Бу геннар өстәмә таблицада күрсәтелгән. HGT белән бәйле булган барлыгы 77 генның SNP бүленеше анализланды, һәм 26 полиморфик мәйдан ачыкланды, күпчелек очракта (78%) синоним булмаган (NS) үзгәрешләргә китерде (өстәмә таблица 2). MTBC геномы буенча алдагы эш шуны күрсәтте: HGT өлкәсе геномның калганнары белән чагыштырганда NS SNP нисбәтен күрсәтә. Әгәр дә бу рекомбинация өлкәләрен MTBC ата-бабалары алган дип уйласа, һәм алар борыңгы полиморфизмнарны артык күрсәтәләр икән, синоним үзгәрешләр өлеше югарырак булыр дип көтелә, чөнки аминокислота үзгәрүләре аркасында NS алмаштырулары тискәре сайлау белән юкка чыгарылыр дип көтелә. Шуңа күрә, безнең нәтиҗәләр шуны күрсәтә: функциональ нәтиҗәләр HGT шикелле геннарны алыштырудан булырга мөмкин, бу аларның кыйммәтле адаптив генетик төрлелеге өчен мөһимлеген күрсәтә.
Бу анализ белән параллель рәвештә, 3R компонентларын кодлаучы геннар (ДНК ремонтлау, репликацияләү һәм рекомбинацияләү) дос Вултос һәм хезмәттәшләр (2008) 39 тарафыннан бастырылган исемлек буенча җентекләп тикшерелде. Бер үк ДНК фрагментларын алыштыру турыдан-туры күзәтеп булмый, гәрчә тыгыз бәйләнешле бактерияләр катнашканда еш процесс булырга мөмкин, мәсәлән, бу мәгълүматлар җыелмасы кебек; өстәвенә, бу процесс ДНКны ремонтлау ысулларының ачкычы булырга мөмкин72, шуңа күрә гомологик рекомбинациядә роль уйнагыз. 54 ген белән таратылган барлыгы 26 полиморфик позиция ачыкланды (өстәмә таблица 3). Бу геннар җыелмасында NS үзгәртүләре нәтиҗәләрнең якынча 65% тәшкил итте, бу Микобактерия туберкулезы штаммнары турында алдагы докладларга туры килә.
Пост вакыты: 21-2021 октябрь